微波诱变法选育四环类抗生素菌种的探索和应用
2009-12-09 14:43:32   来源：本站原创   评论：0 点击：

【摘要】  采用微波诱变法处理四环类抗生素生产菌种——生金色链霉菌(streptomyces aureofaciens)。当微波功率1200w、脉冲频率2450mhz时，辐照4s诱变效果最明显。01?2?17菌株处理后得4?14#菌株。该菌株特性优良，15m3发酵罐试验，37批平均发酵效价高于对照菌株5.9%。处理另一株四环类抗生素生产菌种44#，选育出27#菌株，摇瓶复试效价高于对照10.5%以上。

【关键词】  四环类抗生素； 微波； 诱变； 发酵； 生金色链霉菌

微波在生物学上主要用于杀菌、刺激植物种子发芽生长［1］。随着人们对微波的生物学效应及微生物特点认识的深入，微波在工业微生物诱变育种中也应用得越来越广泛［2］，与紫外线、离子注入、抗癌药物、染料等方法处理菌种相比较，微波处理法具有操作简单、费用低、安全性高、对环境污染小等特点。本试验探索了微波对四环类抗生素生产菌种——生金色链霉菌(streptomyces aureofaciens)的诱变效应。

    1  材料与方法

    出发菌株为01?2?17和44#(四环类抗生素生产菌株)。

    1.2  培养基

    四环类抗生素菌种选育常规培养基。

    1.3  诱变处理及筛选方法

    (1)孢子悬液的制备  向生长好的出发菌株茄瓶斜面中加15ml无菌水，制成孢子悬液，移入一含有20个玻璃珠的三角瓶中，摇床振摇30min，过滤、稀释。

    (2)诱变处理

    单次处理  取10-1稀释液10ml，放入玻璃试管中在微波炉中处理。微波诱变采用微波炉最大功率1200w，脉冲频率2450mhz，以辐照不同的时间对孢子进行诱变处理。

    累积处理  取10-1稀释液10ml，放入玻璃试管中在微波炉中处理，处理不同时间后冰水冷却1min继续处理。处理采用微波炉最大功率1200w，脉冲频率2450mhz，以辐照不同的时间对孢子进行诱变处理。

    (3)稀释分离  将处理过的孢子液稀释至10-5，取每个稀释度的0.1、0.3和0.5ml孢子液涂平板，最适温度培养至长好。

    (4)摇瓶筛选  挑选单菌落接于斜面培养基上，最适温度培养好后，挖块接母瓶、发酵瓶，摇床振荡培养7d后放瓶测定化学效价。挑选高效价菌株埋砂土管，进行摇瓶复筛、特性考察。

    (5)效价检定

    化学检定方法  样品用盐酸酸化后，经滤纸过滤取滤液，用纯化水适当稀释后，加显色剂显色，在可见光的固定波长下检测，根据吸光度强弱计算效价(方法出自华北制药sop?106?生化?57)。

    2  结果与分析

    2.1  微波的诱变效应

    微波诱变菌种辐照时间分别为3、4、5和7s，统计正变率和死亡率。结果显示，微波处理时间4s时菌种正变率最高，为较好的选择，这时的死亡率一般在30%左右。随着处理时间的延长死亡率增加，正变率反而下降。在平板分离培养基上分离单菌落，菌落形态变异率较小。对由01?2?17为出发菌种获得的单菌落进行摇瓶初筛，选出6株菌进行摇瓶复筛，其中最高的一株效价比对照高7.1%，菌号定为4?14#(表1)。

    2.2  微波的累积诱变效应

    微波诱变菌种首次辐照时间分别为3、4、5和7s，之后用冰水冷却，1min后继续分别处理3、4、5和7s，统计正变率和死亡率。

    微波累积处理生金色链霉菌，时间仍以4s时菌种正变率最高，为较好的选择，但与单次微波处理相比，微波累积处理整体效果稍差。在以上累积处理条件下，死亡率在20%～85%之间，死亡率并没有随处理总时间的加倍而成倍增长。在平板分离培养基上分离单菌落，菌落形态变异率仍较小。对由另一株生金色链霉菌   表1微波处理后摇瓶复筛效价44#为出发菌种获得的单菌落进行摇瓶初筛，选出4株菌进行摇瓶复筛，其中最高的一株发酵效价比对照高10.5%，菌号定为27#。

    2.3  菌种遗传特性研究

    对4?14#菌株及对照菌株、27#菌株及对照菌株进行代谢考察。将菌种分别接发酵摇瓶，在培养72h后每日取样测ph、c、n及摇瓶效价。结果4?14#菌株糖氮代谢均快于对照菌株，ph变化与对照菌株相近，放瓶效价比对照高14.5%；27#菌株糖氮代谢稍快于对照菌株，ph变化比较平稳，放瓶效价高于对照9.2%。

    4?14#和27#菌株传至二代、三代砂土孢子时，摇瓶效价与原菌株基本持平。

    2.4  生产试验结果

    4?14#菌株在15m3生产罐上进行试验，表现为氨氮代谢快、起步效价高、后劲足、放罐体积大的特点。统计半年试验结果，4?14#菌株37批，对照菌株44批，平均发酵效价前者高于后者5.9%。现已全面推上生产。随着工艺优化，该菌株发酵效价逐步提高，多次创单罐批发酵效价历史最高记录和月平均效价历史最高记录，取得了显著的经济效益。

    3  结论

    微波处理诱变效果不亚于传统理化因子。本文对四环素产生菌株01?2?27和44#菌株处理后4?14#菌种的发酵效价明显高于对照菌种。

27#菌种还有待上生产罐检验

【参考文献】
  ［1］ 梁海曼，周菊华. 热击在植物组织培养的应用前景［j］. 广西植物，1992，12(1)：64～75.

［2］ 李永泉，贺筱蓉. 微波诱变和激光诱变相结合选育金霉素链霉菌的研究［j］. 生物工程学报，1998，14(4)：445～448.