在制备β-内酰胺抗生素的酶缩合反应过程中，不可避免地会产生逆反应——水解反应，即反应产物由于酶的作用再逆分解成原料，这对提高反应产率是很不利的，为提高酶缩合反应的产率，侧链对母核的投料量大大过量，这造成了侧链的过高消耗，并在产品中引入了不需要的杂质，对生产来说仍是不经济的。Maur- iZi报道酶缩合反应制备头孢氨苄，向反应体系中加人少量的酶抑制剂（苯乙酸、苯氧乙酸、扁桃酸等），可降低酶解作用，同时又不会对酶催化缩合反应产生太大的影响，从而可以得到较高的反应产率，大大降低侧链的投料量，使侧链与母核的投料比例降到2：1以下。    2.2 酶催化氯化反应    酶催化β-内酰胺抗生素合成研究，对其酰化缩合反应报道较多，最近，开始对酶催化氯化反应有研究报道。从微生物Rathayibacter种中分离制备对头孢菌素氯化过氧化物有活性的酶，在pH6.0磷酸盐缓冲液中，加人氯化钠和3％过氧化氢溶液，此种酶可将廉价的头孢氨苄转为价高的头孢克罗。仅有Rathayibacter biopuresis能产生头孢菌素氯化过氧化物酶。现转化率不高，如能提高转化率，将对头孢克罗的生产产生巨大的影响。    2.3“一锅法”酶法研究情况    酶法合成β-内酰胺抗生素，一般一步反应在一个反应器中进行，近年来，有人将几步酶法反应（例水解缩合或缩合缩合等）在一个反应器中进行，这样，不需分离中间体，简化了过程，有利于工业化生产，这将是酶法合成的趋势之一。    Ternadez-Lafuente等报道新型化学酶法合成头孢唑林，通过D-氨基酸氧化酶、戊二酰化酶和青霉素G酰化酶催化作用，生物转化头孢唑林。以头孢菌素C为起始原料，在水溶性中，经三步酶法和一步化学法合成头孢唑林，不分离纯化中间体，每步酶法收率接近100％。先将头孢菌素C酶法脱乙酰基，然后由 DAO和GA催化，再由PGA固定化酶（来源Esh- erichia coli ATCC11105)进一步催化酰化7-ACA，得到7-[(1H-四氮唑）-乙酰氨基]-3-乙酰氧甲基-△3-头孢烷酸，最后与MMTD侧链化学法缩合得到头孢唑林。    Wegman等报道，自苯甘氨酸腈二步酶法转化，一锅法制备头孢氨苄。腈水解酶（来源R. rhodochrous）催化水解D-苯甘氨酸腈为酰胺，然后在青霉素酰化酶(E.C.3.5.1.11)作用下，7-ADCA与 D-苯甘氨酰胺缩合，得到头孢氨苄。然后将1，5-二羟基萘加至反应液中，与头孢氨苄一起结晶，这使得反应液头孢氨苄浓度很低，避免了水解，收率79％，合成／水解比7.7。研究还显示D-苯甘氨酸腈显示对青霉素 G酰化酶有明显选择抑制效果。    Schnien等报道己二酰7-ADCA水解和头孢氨苄酶法合成一锅法完成，所用酶为固定酰胺化酶（来源 Escherichia coli），缩短了头孢氨苄制备过程。 酶水解 苯甘氨酸酯或酰胺 己二酰7-ADCA————→7-ADCA————————→头孢氨苄 青霉素酰化酶    3 产品的分离与纯化    在酶法制备β-内酰胺抗生素的技术中，产品的分离及纯化是一项关键性技术，由于所用原料侧链、母核和产品的理化性质相近，采用普通方法难以达到分离提纯的目的，因此该问题一直是酶法合成β-内酰胺抗生素生产的一大障碍。目前使用的回收纯化方法有多种，如：酸碱结晶法、浓缩结晶法、化学法（如萘复合物法）、柱色谱法、纳米滤膜法、两相萃取法等。这些方法各有    优缺点，还需进一步的改进和完善。 采用酸碱结晶法分离产品，可以不用有机溶剂，避免了对环境的污染。但是此法不能把产品一次分离干净，母液中残留的产品仍需浓缩结晶或其他方法加以回收处理，而且产品纯度也不够理想。    利用头孢菌素与萘类化合物形成复合物的方法比较简单可行，反应体系中的产品几乎可以定量地与萘类化合物形成复合物，从而得到完全分离。此法非常适合有酶存在的反应体系。如能解决回收蔡类化合物的问题，这将是一个非常好的分离纯化工艺。    Wegman等报道一锅法制备头孢氨苄，将1,5- 二羟基蔡加至反应液，与头孢氨苄一起结晶，这使得头孢氨苄浓度很低，避免了水解，收率79％。    Schroen等报道，在酶法合成头孢氨苄过程中，同时将产品通过与萘类衍生物形成复合物，这些复合物易结晶，复合物为复合剂与头孢氨苄按一定比例组成。复合物的形成利于防止不需要的水解。优化了反应条件,pH7.5,温度25℃为最适宜条件。讨论了产物形成复合物对反应的影响，在大多情况下，有好的影响，水解被抑制。特别是复合剂为1，5-二羟基萘，酶为液态酶，这样可得到高浓度的头孢氨苄。    采用两相萃取法分离提纯产品，是一个较好方法。 Hernandez Justiz等报道由动力学控制的酶法（自大肠杆菌的青霉素酰化酶）缩合头孢氨苄，通过连续萃取水溶性产品（周围是酶），从而使收率提高，这样，可避免酶快速水解。将酶以共价键固定于多孔载体上，反应开始前，孔状结构载体可以洗涤，用其中一相填充，这样，当事先平衡好的生物催化剂与第二相混合（那里反应产物将被萃取），固相酶保留于开始选择的第一相中。首次评估了在不同二相体系中头孢氨苄分配系数。在剧烈条件下，可获得高的分配系数。在100％聚二乙醇600-3mol/L,硫酸铵体系中，头孢氨苄被萃取到聚乙二醇体系中，可获最佳分配系数。固定化青霉素酰化酶在硫酸铵中，然后进一步悬浮于100％聚乙醇600 中，这样，可得到90％头孢氨苄合成收率，这里苯甘氨酸甲酯浓度150mmol/L，7-ADCA浓度l00mmo1/L。在这个反应体系中，固相酶留在硫酸铵水相中，由于将产品连续萃取到聚乙二醇相中，使头孢氨苄的水解得到抑制。相反，在单相体系中，由于头孢氨苄的快速水解，综合收率低于55%。    4 酶反应器研究    酶催化法合成β-内酰胺抗生素生物反应器主要有填充床生物反应器、搅拌槽式生物反应器、膜式生物反应器等，现研究较多的是膜式生物反应器。    Tarvascio等报道非均热膜生物反应器用于酶法合成头孢氨苄的情况。一种新的疏水性的催化膜，通过青霉素酰胺化酶E.C.3.5.1.11（来源Escherichia coli）固定在尼龙膜上，尼龙膜与甲基丙烯酸丁酯相连接，六亚甲基二胺和戊二醛分别作间隔基和偶合剂。以青霉素G酰化酶作催化剂，7-ADCA和苯甘氨酸甲酯缩合，对pH、温度、底物浓度等反应条件进行了考查。结果显示事先处理的酶有较好的结果，增加了固定化酶对pH和温度的稳定性。活化能的计算显示，通过固定化酶的生物催化制备头孢氨苄受到分散限制，导致酶活性和底物亲和性减弱。梯度温度作为减少分散限制性一种方法。实验表明，随着温度梯度变化，头孢氨苄呈线性增加，温度相差3℃，头孢氨苄合成增加 100％，产品制造时间减少50％。非均热生物反应器克服了分散限制性，Km值降至接近自由酶的Km值，减少由于固定化过程酶的失活。    Wenten等报道网状纤维膜反应器的情况，青霉素酰化酶E.C.3.5.1.11固定在膜孔上，连续水解青霉素G。研究了不同操作条件对固定化酶反应的影响。固定化结果显示青霉素酰化酶可固定90％以上。由于6-APA分子比膜孔小，溶质通过膜自由分散。然而，固定化酶截留了35％溶质。而且固定化酰化酶Km （8.04mm）比游离青霉素酰化酶(7.75mm)略高。低流速可以避免胶体形成或酶从膜孔释放，从而最大限度达到转化。    5 结束语    随着人们对β-内酰胺抗生素的酶法合成深人研究，相关的工业技术快速发展，人类对自身生存环境状况日益重视，β-内酰胺抗生素的酶法合成将是21世纪 β-内酰胺抗生素发展的必然趋势之一。 （中国抗生素杂志第29卷第11期）