动物细胞的大规模培养技术
2009-05-27 12:29:54   来源：本站原创   评论：0 点击：

大规模培养哺乳类细胞是生产许多临床和医学上重要生物制品的一种有效的方法，这些生物制品包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单克隆抗体等，推动了生物学和医学的发展，给医学卫生事业带来了巨大的社会效益和经济效益。基因工程技术、细胞工程技术，以及新的细胞大规模繁殖培养系统的发展，是构成上述成就的主要原因。然而，体外大规模繁殖真核细胞要比原核细胞困难得多，如细菌、酵母菌和霉菌的细胞壁厚，能耐受搅拌，不易破碎，营养要求低，生长条件易于控制，增殖周期短，产品的产量也高，目前国外已用20万L发酵罐进行生产。而真核细胞膜薄而娇嫩、易碎，对营养要求高，大多数细胞必须贴壁附着生长，更重要的是真核细胞具有原核细胞所没有的功能，能对其分泌产物进行修饰，例如二硫键的形成、糖甲酰化等，使产物具有完整的生物学功能，另外原核细胞经基因工程技术所合成的生物制品，不是分泌型的而是同细胞相结合的，需要破碎细胞，释出产物，再经浓缩、纯化；因后加工过程复杂，而使产品的得率受到损失。利用真核细胞，可以不断合成和分泌，不断收获，后加工过程也相对简单，而且细胞往往可以重复利用。因此，利用培养的动物细胞生产的生物制品，仍有很高的市场价值。

实验室常规培养动物细胞的方法是用人工合成培养液加上一定量的小牛血清，将细胞放在不同的容器中进行培养，如微孔板、培养皿以及各种培养瓶等。一船培养容器的体积很小，最大培养体积为1%26mdash;2L。用这种方法培养的细胞所分泌的产物是有限的，无法满足实验研究和应用研究的需要。利用小鼠腹水法繁殖杂交瘤细胞生产各种单克隆抗体；虽然能获得较高浓度的单克隆抗体，一般每只小鼠腹水单克隆抗体浓度在10mg／m1左右，但不易控制动物的批间差异和非特异的小鼠免疫球蛋白，以及潜在感染因子的污染。单克隆抗体纯度差，分离纯化难度大，成本不低，又不宜用于人体内的诊断和治疗。因此，不可能作为大规模生产单克隆抗体的主要方法。

应用细胞工程技术，建立大规模细胞培养系统生产各种生物活性物质，是一种比较经济可靠的技术。据不完全统计，全世界现有一万多个实验室，400多家工厂从事生物技术产品的研制。近几年来，已研制了几种具有很大前途的技术。具有代表性的有气升式深层培养系统、微载体培养系统、微囊培养系统、大载体培养系统以及中空纤维培养系统。上述五种培养系统均能生产不同的生物制品，它们具有不同的技术特点，但仍需不断完善。中空纤维培养系统和大载体培养系统较为先进，用途更广，似乎更有发展前途。

一、大规模细胞体外培养系统的基本要

（一）新型培养系统的设备

现有的常规搅拌式发酵罐不能满足现代生物技术在体外大规模培养动物细胞的技术和经济要求，必须加以改造，以达到模拟动物体内细胞高密度的生长环境，扩大体外培养细胞的表面积和增加细胞密度同体内细胞一样生长。无菌操作安全可靠、保温和气体交换系统优良，可靠的泡沫控制和适于大批量的混合装置，能保证pH值之稳定；抗泡沫剂、氧气和温度等监测并使其尽快地达到均一。清洗方法简便快速，监视控制自动化，制造用料合适；方法合理，成本低；体积要小而使用方便，并适于多种产物的使用；便于扩大生产等。根据上述要求，要研制一台理想的细胞培养系统需要多学科的专家，如生物学家、机械学家、电子工程技术专家共同研究、设计，并与生产部门密切合作才能达到要求。

（二）细胞株(系)的选择

微生物污染是大规模细胞培养的主要危险。设备、培养液、支持系统和操作方法的复杂性都会引起微生物污染。其中支原体对动物细胞培养威胁最大。因为它们的感染力很高又不易被检测。因此，细胞在使用前必须经过严格的检测。另外，细胞在体外生长时要保持良好的生长速率和分泌功能。为了保持高产稳产的细胞株(系)，应该定期进行筛选工作；为了防止意外事故发生，应将没有支原体污染的细胞定期进行低温保存。

（三）培养液的选择

培养液选择一般是根据所采用的细胞株(系)而定，在原来的基础上加以改良，达到规模培养细胞的要求。大规模培养细胞的培养液中，血清用量大，质量不易控制，生产成本也高，且使产品的后加工增加了一定的难度。为了减少血清用量，就要逐步驯化细胞，使其适应于低血清或无血清培养液。现有两类适用于某些动物细胞的无血清培养液：一种是用激素或其他大分子加入培养液；另一种是以特殊的营养物质(如小牛淋巴液等)替代合血清的培养液配方。利用这两种培养液培养某种细胞都获得了满意结果。但是，值得注意的是在无血清培养液中更可能出现细胞毒(这与水中的微量元素或有机物污染有关)。因此，在培养液制备时必须采用高纯度的水。培养液一般需经o．22／%26mu;m的微孔滤膜过滤消毒，最近美国Millip公司生产一种0．1%26mu;m的多层正压过滤器能除去支原体的污染。

（四）细胞生长状况的监测

1、温度控制 动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于370c，细胞生长缓慢；温度高于%26rsquo;37cc，细胞失去存活力。因此，动物细胞培养比多数微生物培养对温度控制具有更为严格的要求。一般培养液温度由铂电阻温度计来监测，其灵敏度为 %26plusmn;0．025Gc。温度计信号经微机反馈控制器处理后控制反应器的能量输入。培养容器的温度控制误差约在i %26plusmn;0．05cc之内。大多数加热器固定在容器外面，带有大面积衬垫。采用这样的加热系统可提供大的热交换表面，消除局部热点，减少温度梯度的形成。

2、pH控制 pH值是细胞培养的关键性参数。它影响细胞的存活力、生长及代谢。细胞生长的最适pH值因细胞类型不同而异，范围为7．0%26mdash;7．5左右。缓冲液系统通常用C02、碳酸氢盐调节，pH值取决于培养液中的C02和碳酸氢盐的浓度比。 加入C02即pH值降低，而加入碳酸氢盐则使pH值升高。在培养初期阶段细胞产生的C02和乳酸量较少，C02可以从系统中置换出来。在细胞生长的后期阶段，细胞密度增加，由于细胞产生的cob和乳酸量增加，使pH值变得偏酸。这可根据需要用加酸或加碱液的方法，对pH值加以控制。但此法有产生局部pH值和增加培养液渗透压的危险。控制pH的较安全的办法，是通过供给细胞所需的氧而改变通人反应器气流中的C02浓度。用C02控制pH值会强烈地受溶氧控制系统的影响，这因为控制溶氧(空气、N2或02)而加入的任何气体都将导致C02的被置换，从而引起pH值升高。因此，在设计pH值控制系统时，应顾及溶氧控制。

3、溶氧(DO)的测量与控制 溶氧是细胞代谢中的重要养分。 它可以影响细胞的产率，且间接或直接地影响细胞的代谢。在低氧压下，细胞往往生长缓慢。而氧压过高，使培养液会变得对细胞具有毒性。人们已发现溶氧的最适水平是依赖于不同细胞的类型，空气饱和度应在10%26mdash;l00%的范围内。可根据需要向培养液内加入氧气、空气或氮气控制溶氧。值得注意的是，pH值控制可以影响溶氧控制。在设计过程中应有一种控制器，通过调节输入反应器的空气、氧气、氮气和二氧化碳各类气体的混合比例，使溶氧与pH值的控制结合在一起。

4、葡萄糖和乳酸的监测 为了及时了解大规模培养细胞的健康状况，应逐日或隔日吸取培养浓样品进行乳酸的产量及葡萄糖摄人量的测定，以便监测细胞生长的动态状况。操作方法可参照Sigma技术报告。

5、产物的收集和检测 根据大规模培养系统中的pH、D0数值及葡萄糖、乳酸等参数的动态变化，监控细胞生长状况，并定期抽样检测细胞分泌产物的含量。应用不同类型的细胞，采用不同的产物检测方法。一般用免疫荧光间接法、血凝法、免疫酶标法以及放射免疫法等。 一般产物的收集可采用批量收集和微机程序控制连续收集两种方

二、几种大规模细胞培养系统

（一）气升式深层培养系统

英国celltech公司研制的全自动气升式深层培养系统有独到之处，在国际上居领先地位。几年来该公司研制这种培养系统从5l，301，100L到1000L6到1985年底已建成具有5个1000L气式培养系统的车间。气升式培养系统中是使用低血清或无血清培养液。每次培养周期为两周。每升培养液可生产40%26mdash;500mg的单克隆抗体，若其产量恒定，平均为102mg。10L培养系统一年可生产508单克隆抗体，100L生产500g，而1000L则可生产5kg。

全自动气升式深层培养系统为全部密闭结构。混合气体自培养器底部管道输入，气体沿着培养器中央的内管上升。一部分气体从培养器的顶部逸出，另一部分气体被引导沿培养器的内缘下降，直达培养器底部和新吹入的气体混合而再度上升。这样借助气体的上下不断循环搅动培养器内的细胞，使之不贴壁。通过微机程序控制混合气体的组分，维持培养液内一定的溶氧张力和pH值。该系统具有几个优点：1)没有移动部件；2)完全密封；3)便于无菌操作；4)不易污染；5)设计简单；6)便于放大生产；7)氧的转换率等，满足了该培养系统中细胞在生长时所需的要求。

（二）微载体培养系统

微载体大规模培养动物细胞是1967年Van Wezel首先创立的一种方法。其基本原理是利用固体小颗粒作为载体，细胞在载体的表面附着，通过连续搅拌悬浮于培养液中。并成单层生长繁殖。由于扩大了细胞的附着面，能充分利用生长空间和营养液，因此大大提高了细胞的生长效率和产量。微载体是由天然葡萄糖聚合物(葡聚糖)或者各种合成的聚合物组成的，其直径由50%26mu;m到数百微米不等。目前商品化的微载体有CytodexI，II，III，biocarrier，gelibead以及DEAE%26mdash;cellul03e等。该系统具有的特点： 1)表面积增大；2)生长环境均一，条件易于控制；3)取样及细胞计数简单；4)细胞与培养液易于分离；5)大规模培养只需对微生物发酵罐或气升式深层培养系统稍加改进即可；6)适合于培养原代细胞、二倍体细胞株，它对生产重组产品来说是必不可少的有效方法。

朱德厚等(1982)根据微载体培养的原理，自行设计一套微体悬浮培养系统，选用DEAE%26mdash;sephadex%26mdash;A50及Cytodex%26mdash;I两种微载体，以每瓶100一120Ing／I 00万细胞的浓度，转速50r／min，37cc恒温条件下培养Hela(入子宫颈癌细56)、 BEL%26mdash;7402(人体肝癌细胞)及CBRH%26mdash;7919(大鼠肝癌细胞)三种细胞系，结果表明，培养5%26mdash;7天内其产量分别可增加63．5，31及95倍，远较文献报道为高。95%的微载体上都有培养细胞茂密生长繁殖，并进行直接分裂及有丝分裂，活细胞率在90%以上，且有进行亮氨酸掺入的功能。同时，测定培养细胞总蛋白量及同位素掺入量，可作为判定细胞实际产量和功能状态的指标。

该培养系统为细胞生钩学研究和病毒及其他生物制品的生产提供了大量的细胞，且可为某些不能在悬浮培养情况下生长的细胞，如原代细胞、二倍体细胞的转向悬浮培养及大量繁殖提供有效的手段。

（三）微囊培养系统

70年代，Lin和sun把生物活性物质、完整的话细胞或组织包在薄的半透膜中，即称为微囊技术。该技术在无菌条件下，将活细胞或生物活物质悬浮在1．4%海藻酸钠溶液(alginate s01uri。n)中，通过特制的成滴器(disFenser)，将合有细胞的悬液形成一定大小的小漓，滴入氯化钙溶液中，形成内含活细胞的凝胶小珠。每一个胶化的小珠，再用长链氨基酸聚合物、多聚赖氨酸包被，形成坚韧、多孔可通透的外膜。膜孔的大小可根据需要而改变。重新液化胶化小珠，使其成胶的物质从多孔膜流出，活细胞或生物活性物质留在多孔外膜内，放人气升式培养系统中进行增殖。微囊内的活细胞由于有半透性微囊外膜，可以防止污染和物理损伤。营养物质和氧分子可通过膜孔进入囊内，细胞代谢的小分子产物可排出囊外，分泌的大分子产物如IgG，不能透过膜孔，积聚在囊内。囊内细胞由于得到充分的营养，可获得高达1．4%26times;10。／ml的细胞密度。细胞密度大，分泌产物量高。该系统培养周期为2%26mdash;3周。抗体浓度大，可达1%26mdash;10mg／ml，为常规培养的50%26mdash;100倍。收集培养过的小珠，离心沉淀，用生理盐水洗涤，除去粘附的培养液，再用生理盐水洗涤，用物理方法破碎小珠，离心去除小珠碎片及细胞，抗体留在上清波中，其起始纯度可达40%26mdash;75%，在某些应用中可直接使用此抗体，经过纯化可得到95%以上纯度的产品。微囊培养系统不仅成功地培养了许多种杂交瘤细胞株，生产大批量的单克隆抗体，而且也成功地用于重组DNA，遗传工程技术产品的大量生产。还用于埋藏活细胞或组织于动物体内，治疗某些疾病。

该系统具有几个特点：I)细胞密度大；2)产物单位体积浓度高；3)分离纯化操作经济简便；45抗体活性、纯度好。但微囊技术成功率一般只有50弗左右，培养液用量大，囊内部分死亡细胞对产物的污染，这些问题还有待进一步研究改进。

（四）大载体培养系统

美国Bellc生物工程公司新设计的大载体培养系统，是一种新型的大规模培养细胞装置，配有先进的主要部件，如溶解氧、pH测定以及培养液输入和产物的收获均由微机程控调节。培养器外面套以水浴玻璃缸加温。混合气体从培养器底部输入使细胞悬浮培养，通气量大而对细胞损伤减少到最低程度。大载体是由海藻酸钠构成，海藻酸钠含有重复排列的葡糖醛酸和甘露糖醛酸，在钙溶液中形成适宜于附着的网络状凝胶珠。在收集细胞时，可用Na%26mdash;EDTA和枸橼酸钠，使细胞从凝胶中分离出来。

大载体的制备过程如下

配制50圆m01／L氯化钙溶液。经蒸气高压灭菌后，由输入泵注人培养器中1750m1。将收集的细胞悬液体积为25m1，注入到930mI无菌低枯度的海藻酸钠(Bellco公司产品)凝胶中充分混匀。

通过喷珠装置，由输入泵将细胞混合液根据需要的速度喷珠于氯化钙溶液中，使聚合

成携带细胞的大载体其直径约2．6mm。

喷珠结束后，抽出氯化钙溶液，另注入生理盐水洗涤两次。最后注入2000ml的培养液进行气升式悬浮培养。

该培养系统连续生产周期约三个月以上，已培养过10多种有经济价值的细胞株，生产单克隆抗体和干扰素产品获得满意的结果。

该系统的优点是：1)操作控制方便，可随机取样检测；2)人工增加附着细胞密度高；3)消耗用品价格低廉，产物收获量大，有明显经济效益。该系统不具有细胞分泌产物的浓缩装置。

我们从1987年引进美国Bellco公司生产的大载体培养系统，生产抗人13单克隆抗

体作为人血型定型试剂的工作取得成功，以代替来源紧张、价格昂贵的高效价人血清，如果推广应用将会取得了显著的社会效益和经济效益。

（五）中空纤维培养系统

l972年，Kna2ek等研制成中空纤维培养系统。1984年，美国Amicon公司又研制一种分折用的中空纤维培养器命名为VitafiberT%26ldquo;I，II，III等三种型号。1985年，美国Endotronic s公司又进二步作了改进，主要解决了中空纤维培养系统长期存在的问题：1)细胞梯度形成；2)微环境形成；3)缺氧区的形成，从而使中空纤维培养系统的产品从实验研究发展成为商品生产。该公司生产四种不同水平的中空纤维培养系统(包括大规模生产系统和实验研究系统)。中空纤维是用聚砜或丙烯的聚合物制成。管壁的厚度约50%26mdash;75%26mu;m，似海绵状，宫合毛细管。管的直径为200%26mu;m。管壁是极薄的半透膜。它能截留住分子量分别为1%26times;104、5%26times;104、10%26times;104道尔顿三种。一个培养筒内由数干根中空纤维所组成， 然后封存在特制的圆筒里，就组成了一个新颖的中空纤维培养系统。因为这种纤维内部是空的，纤维之间有空隙，所以在圆筒内就形成了两个空间：每根纤维的管内成为%26ldquo;内室%26rdquo;，可灌流无血清培养液供细胞生长，管与管之间的间隙，就成为%26ldquo;外室%26rdquo;，接种的细胞就贴附%26ldquo;外室%26rdquo;的管壁上，并吸取从%26ldquo;内室%26rdquo;渗透出来养分，迅速生长繁殖。培养液中的血清也输入到%26ldquo;外室%26rdquo;，由于血清和细胞分泌产物(如单克隆抗体)的分子量大而无法穿透到%26ldquo;内室%26rdquo;去，只能留在%26ldquo;外室%26rdquo;并且不断被浓缩。当需要收集这些产物时，只要把管与管之间的%26ldquo;外室%26rdquo;总出口打开，产物就能流出来。至于细胞生长繁殖过程中的代谢废物，因为都属小分子物质，可以从管壁渗进%26ldquo;内室%26rdquo;，最后从%26ldquo;内室%26rdquo;总出口排出，不会对%26ldquo;外室%26rdquo;细胞产生毒害作用。一般细胞在接种1%26mdash;3周后，就可以完全充满管壁的空隙。细胞厚度最终可达10层之多。细胞停止增殖后，仍可以维持其高水平代谢和分泌功能，长达几个星期甚至几个月。

美国Endotronics公司生产的Acusyst-JrTM中空纤维培养系统，其培养器的容积为100ml，表面积1．1%26mdash;1．3m2 中空纤维%26ldquo;内室%26rdquo;半透性膜孔径可阻抑分子量6000%26mdash;10000道尔顿以上的生物大分子通过。培养器与两个不同流向的循环系统(组合循环和扩张循环)相连，为培养细胞的持续生长，增殖形成一个理想的环境条件。在组合循环流向中装置着伸缩泵，类似哺乳动物的心脏，为管道流动的培养液增加压力，以消除营养扩散梯度的形成，使整个细胞群体可以均衡地获得充分营养和氧气供应以及去除代谢废物。各种参数均由微机控制。产物收集也由输入微机的指令自动进行。该系统的优点是：1)培养器体积小，细胞高密度生长；2)浓缩产品的功能；3)产物纯度高；4)自动化程度高，细胞生长周期长。其缺点是：由于中空纤维每次生产的消耗品价格尚贵，如果使用不当会增加生产成本。

我们于1986年曾引进Acusyst-JrTM中空纤维培养系统生产抗人肝癌细胞的单克隆抗体和入A单抗作为血型定型试剂，连续生产分别为4%26mdash;6个月，获得大量较高效价的产品i为肝癌的基础研究和临床的导向治疗打下了物质基础，同时抗A单抗经初步应用也显示有显著的社会效益和经济效益。

三、大规模细胞培养技术的应用

近几年来，已把巨大的人力和资金投入到开发大规模细胞培养技术上，将能加快发展．步伐，进一步应用遗传修饰的哺乳动物细胞生产单克隆抗体和其他精细的糖蛋白。获得有药物作用的蛋白质(如病毒抗原、哺乳动物抗体和酶)是十分复杂的过程，要求分子有精确的折叠和糖基化，这些要求在细菌和酵母体内却难以得到满足。然而，采用杂交瘤和重组DNA技术往往可以使动物细胞产生和分泌出一定数量的有用蛋白质。正是这个原因，在今后10年内，大规模的动物细胞培养在药物产品的生产方面具有重大的价值。

（一）疫苗

传统上一直把细胞培养产物用于人类和牲畜的病毒疫苗，这些疫苗至今已被大规模应用。口蹄疫苗是用大规模细胞培养方法生产的主要产品之气。1983年，英国Wellcome公司用于生产口蹄疫苗的细胞培养液的竟高达210万L以上。其他产品如狂犬病、脊髓灰质炎和牛白血病等病毒疫苗，以及HTLV%26mdash;1也是用这种方法生产的，不过其产量较低。美国Genentech公司应用SV40为载体，将乙型肝炎表面抗原基因插入哺乳动物细胞内，已获得高效表达，制成乙型肝炎疫苗，目前正在临床试验。

（二）干扰素

到70年代后期，许多公司和研究所都采用大规模细胞培养技术，从连续培养的细胞株中生产干扰素。最近，日本和欧洲已大量生产%26alpha;和%26beta;干扰素，英国wellcome公司为了满足临床试验的需要，采用8000L Namalwa细胞生产%26ldquo;干扰素。英国Celltefh公司用．自动气升式培养系统生产%26alpha; ，%26beta;，%26gamma;干扰素，产品已行销全世界。从人二倍体成纤维细胞(培养在1000L以上发酵培养器内的微载体上)生产%26beta;干扰素是这个领域的一个重大进展。

（三）单克隆抗体

单克隆抗体在体外诊断、体内造影、人和家畜的治疗以及工业上的应用(如免疫纯化)日益广泛，需要量可达数百克。有些系统的单克隆抗体的需要量在今后几年内将迅速增加到几公斤的数量级。为此，迫切需要更有效的生产方法。采用传统方法(小鼠或大鼠的腹水瘤培养法)生产单克隆抗体，已不能适应实际需要。应用大规模细胞培养系统生产各种不同的单克隆抗体是经济可靠的方法。如英国Celltech公司采用10100和10001自动气升式培养系统，培养各种生产单克隆抗体的小鼠、大鼠和人的细胞株，生产各种单克隆抗体的产品。到目前为止，已成功地在1000L培养系统中，采用无血清培养液生产优质的单克隆抗体。法国输血中心大量制备可分辨A，B和AB型的单抗血型诊断盒。1988年，我们与上海市血液中心协作，应用大规模细胞培养系统，生产抗A和抗B单克隆抗体作为血型定型试剂取得成功。中空纤维培养系统和大载体培养系统一次运转达6个月和 3个月即可收获两种单克隆抗体效价在规定标准以上的产品达50L，经过临床11万例的血型鉴定应用，无一例产生血型错判，达到80年代同类产品水平。并可节约人血100L，这一产品的推广应用和批量生产将有明显的社会效益和经济效益。其他一些国家先后制备成测定血和尿中的各种激素、特殊蛋白质、血型、各种药物、诊断细菌性或病毒性病原等的单克隆抗体诊断试剂盒。

（四）基因重组产品

目前已认识到在不久将来用常规的微生物学方法不能实现遗传工程的效益，人们对大规模细胞培养的兴趣愈来愈大。动物细胞能精确地转译和加工较大或更复杂的克隆蛋白质。此外，动物细胞还可以把人们所需的蛋白质分泌到培养液内，而从培养液分离蛋白质要比细胞匀浆更为容易。除了单克隆抗体外，现在人们最感兴趣的蛋白质是组织型的血纤蛋白溶酶原激剂(t%26mdash;PA)，以及其他的重组分子。 利用动物细胞培养方式进行大量生产，如免疫珠蛋白G、A和M，尿激酶，人生长激素，乙型肝炎表面抗原等产品均由美国Endotronic公司用Acusyst%26mdash;P型中空纤维培养系统进行生产。

现代细胞工程是当前生物学家、微生物学家、分子生物学家、医学家和化学家共同关心的研究课题，而且它也是我国目前重点的科研项目之一。细胞工程最主要的任务是把生物体系应用于工业生产的工艺过程。也就是直接模仿机体的生长方式和功能，%26rsquo;通过大规模培养系统，生产出各种重要的生物制品。为了实现细胞工程的这个重要任务，首先就要发展各种不同大规模细胞培养系统。