雪莲细胞大规模培养产业化生产药用有效成分
2010-10-24 14:00:08   来源：本站原创   评论：0 点击：

赵德修 金治平 瞿文全 陈亚琼 付春祥
(中国科学院植物研究所,北京,100093)

?水母雪莲（Saussurea medusa Maxim.）系菊科凤毛菊属植物，产于我国甘肃、青海、西藏等地的高山砾石间, 海拔4000米～5100米处。民间用于治疗风湿性关节炎、阳痿、妇女月经不调、胎衣不下、高山不适应症等。最近临床及药理研究证明, 雪莲有延缓衰老及治疗脑动脉硬化等症。雪莲提取物中高车前素hispidulin 和金合欢素jaceosidin 对治疗癌症、抗多种炎症等具有良好的作用。用雪莲研制的雪莲注射液和雪莲风湿胶囊，目前畅销东南亚、香港等地区和国家。但雪莲人工栽培未能成功，由于掠夺性的采挖，雪莲资源已经严重匮乏。为保护国家珍稀植物，满足临床上的需要，我们开展了雪莲植物细胞大量培养生产有效成分的研究。该研究工作综述如下：

1. 雪莲细胞培养工艺学的研究

??1.1雪莲细胞固体培养：
??利用目视法筛选得到的高产黄酮细胞系在固体培养条件下细胞生长率为干细胞20±2 g/L，总黄酮含量为4～5％。培养周期为15～16 d。
??1.2雪莲细胞的悬浮培养：
利用本实验室筛选得到的高产黄酮细胞系, 在摇床上进行悬浮培养，细胞生长量为DW19±1g/L，细胞总黄酮生产量为0.7～1.0g/L。培养周期为12 d。
??1.3雪莲细胞的生物反应器发酵培养：
雪莲细胞在2 L机械及5 L 磁力搅拌生物反应器培养条件下细胞生长量为DW14～16g/L培养物总黄酮生产量为0.5～0.8 g/L，培养周期为12 d.
??研究结果表明水母雪莲细胞培养物黄酮含量高。1996年徐国钧报道（见中国药材学），目前由培养物产生的代谢产物有200种以上，约有30种植物培养物产生的化合物含量接近或超过原植物。文献中列举了17种培养物产生的化合物超过原植物，但仅有5种化合物超过原植物5倍以上。而雪莲培养物产生的黄酮次生产物超过原植物6～7倍。从研究结果还可以看到，水母雪莲细胞悬浮培养周期短。水母雪莲细胞悬浮培养周期12 d, 文献报道三尖杉悬浮培养需要30 d, 固体培养60 d; 人参悬浮培养30 d, 固体培养60 d; 紫草悬浮培养25～30 d。

2. 雪莲细胞生长及其有效次生产物生物合成的调控

??不同理化因子对雪莲细胞生长及黄酮形成的影响
??对八种基本培养基进行筛选，对筛选得到的MS基本培养基又作了培养基成分的调查，如碳、氮源、温度、PH值、光照等对雪莲细胞生长和次生产物的提高均有明显的影响。通过以上培养条件的选择使黄酮产量比原愈伤组织提高2～3倍。
??植物激素及前体和添加物对雪莲细胞生长和次生产物的产量均有一定的影响。在细胞悬浮培养过程中发现植物细胞较微生物生长缓慢（<0.1g/L/d），低产率（0.02g/L/d 或更少）。为了获得更多的有用次级代谢产物，需尽可能地提高培养密度。然而，高密度细胞培养涉及许多技术问题（TANAKA，1981）。这是因为植物细胞具有较硬质的细胞壁，比微生物细胞大10～100倍，因此它们对流变压力有更高的敏感性。植物细胞还有相互聚集，形成聚集体的趋势。一方面在高供氧和强搅拌下，过分扰动会使细胞聚集体破裂死亡；另一方面高密度培养下培养液粘度增大，引起氧和营养物质的传输受限，细胞会因缺乏养料褐化衰竭。我们对不同接种量的研究发现，细胞接种量在3.5gdw/L--5gdw/L的范围内，细胞生长良好，可以达到较大的产量。同时，我们采用了大直径搅拌桨和低搅拌速度，提高了反应器的传输性能。初始接种量4.5 gdw/L，在反应十二天结束后，得到高达19.52 gdw/L 的细胞生长量。
??水母雪莲高产黄酮细胞系遗传性能稳定： 利用固体和悬浮培养，经过20多次的继代调查，实验结果表明水母雪莲高产黄酮细胞系细胞生长及有效次生代谢产物含量稳定。细胞系遗传性能稳定是实现产业化的关键之一。
??水母雪莲适合细胞发酵培养：植物细胞培养工业化生产有效次生代谢产物的关键问题是植物细胞能否生长在大型生物反应器内。我们开展了2 L和 5 L的通气搅拌式发酵培养的研究。实验结果表明雪莲细胞培养物总黄酮生产量为0.8~0.9g/L。此项研究为生物反应器放大培养提供了理论依据。

3. 雪莲细胞培养物中黄酮类有效成分的研究

??已经建立培养物中有效成份高车前素（hispidulin） 和金合欢素（jaceosidin）的分离、提取工艺及鉴定方法。利用HPLC、MS、IR、UV等光谱分析对以上二种活性成分作了结构分析。

4. 雪莲培养物有效成分的初步药理和急毒性实验

??野生水母雪莲和水母雪莲细胞培养物以相同提取方法得到雪莲黄酮粗提物，并以相同方法测定总黄酮含量。利用野生雪莲作对照，观察雪莲培养物中总黄酮提取物对小鼠的抗炎、镇痛和急毒性作用。结果显示细胞培养物有明显的抗炎镇痛作用，作用强度与野生雪莲大致相同。雪莲培养物总黄酮提取物LD 为1262.51mg/kg, 野生的LD 为1250.56mg/kg, 两者基本相同。初步药理实验结果表明，用植物细胞培养物产生的有效次生代谢产物完全可以代替野生植物资源。

5. 雪莲细胞培养物经济效益分析

??从研究结果可以看出，雪莲高产黄酮细胞系遗传性能稳定，培养物有效成分含量高，发酵周期短。用现代化学分析手段和初步药理及急毒实验证明雪莲细胞培养物能够产生野生植物的有效次生产物，以及未发现有毒物质的产生，此项研究为雪莲细胞大规模的培养，以工业化生产有效次生产物奠定了基础。用野生雪莲研制的雪莲注射液和雪莲风湿胶囊对治疗风湿症、偏瘫等具有良好的作用，目前畅销香港、东南亚等地区和国家。高山雪莲生长环境特殊，人工栽培困难，生长缓慢，成熟期需要3－4年，价格昂贵。由于过量采挖雪莲面临灭绝的危险。雪莲有效成份化学结构复杂，难以化学合成。通过植物细胞大量培养生产植物药可不受自然条件的限制，对药物质量容易控制。不占用耕地面积。植物细胞大量培养是利用植物细胞体系，通过现代生物工程手段，进行工业化规模生产，以获得各种产品是一门新兴的跨学科技术。利用细胞培养生产的雪莲总黄酮原材料价格上比野生的大大降低了成本，同时对保护野生资源维护生态平衡具有重要意义。

6. 雪莲的推广应用建议

??雪莲是一种名贵植物药材，具有散寒除湿、壮阳补血、抗炎镇痛、延缓衰老等作用。民间用于治疗风湿性关节炎、妇女月经不调、高山不适应症等。雪莲在计划生育，化妆品等方面开发潜力也很大。 据《江苏中医》报道(1996)，雪莲通脉丸治疗偏瘫82例证明具有良好的效果。
??雪莲花的化妆品系列：雪莲挥发油研制的雪莲系列化妆品（护肤霜，防晒霜，儿童霜）含多种营养和活性成分，渗透性好，易吸水，效果长，有明显延缓皮肤衰老，营养皮肤细胞，增加皮肤弹性等功能。此产品是我国首家获得巴黎国际发明博览会发明奖的化妆品。并获得首届全国轻工业产品博览会银质奖，等6种奖（中国科学报1994, 10, 21)。 新疆中药总厂生产的雪莲注射液和雪莲风湿胶囊对治疗风湿症具有良好的作用。
??雪莲有多种药用功能，利用有效成分的不同极性可考虑雪莲培养物的综合利用。如多糖有终止妊娠以及抗疲劳、抗缺氧等作用，可用于计划生育和保健品（多糖是一类水溶性化合物，可用水作提取溶剂）。、黄酮、生物碱有抗炎、镇痛、强心、平息、降压等作用（中等极性）。
??雪莲不但是名贵中药材，可用雪莲挥发油研制雪莲系列化妆品（挥发油为强亲脂性中药成分，极性小，可选用石油醚作提取溶剂）。

7. 查新及专利申请

??雪莲细胞培养生产有效成分的研究，通过中科院文献情报中心查新，未发现有类似的研究成果。对雪莲细胞高产黄酮细胞系申请了国家专利，专利申请号（No. 00123740.3和 No.00123739.X; ）。此项研究成果的专利申请为今后的成果保护起到重要作用。

8. 雪莲细胞培养物黄酮类生物合成的分子调控

??采用基因工程技术，对植物次生代谢途径进行分子调控，产生出人们所需要的次生代谢产物的植物细胞次生代谢工程是一个新兴的研究热点。
??我们从雪莲细胞培养物中克隆了用于调节3－脱氧类黄酮生物合成调控的关键酶基因（P基因）和用于调控黄酮生物合成的查尔酮合酶基因。正在开展黄酮类生物合成关键基因在雪莲细胞中的高效表达。
??在前期工作的基础上，重点研究雪莲培养物中高车前素和金合欢素的临床、药理试验，开发出抗癌、抗多种炎症和抗衰老的生物工程新药。研究高车前素和金合欢素生物合成关健基因的克隆、表达和调控机理，以提高药用成分的含量。研究适合植物细胞与组织培养的大型生物反应器，类型的设计和构造，使植物细胞培养规模达到400～500 L。与企业合作，建立雪莲植物细胞培养产业化生产原料药物的基地，为推动我国中药的现代化、保护野生资源和生态环境作出应有的贡献。