利用神经网络预测头孢菌素C的生物合成
2009-05-25 14:21:48   来源：本站原创   评论：0 点击：

作者：冀志霞 储炬 庄英萍 张嗣良

【关键词】 头孢菌素C；,,反向传播；,,神经网络；,,预测

　　摘要： 利用头孢菌素C发酵过程积累的数据，建立BP神经网络预估模型，实现以发酵前期的菌浓和pH对效价的预测，将此模型应用于生产实际，分别通过倒种和改变培养基中碳源组成的方法，使头孢菌素C的合成水平分别提高了118%和157%，表明模型具有较好的预测功能。

　　关键词： 头孢菌素C； 反向传播； 神经网络； 预测

　　Prediction of the cephalosporin C biosynthesis by　a back propagation neural network model

　　ABSTRACT The back propagation (BP) neural network model was set up by cephalosporin C fermentation data, and the productivity was forecasted by PMV and pH changing tendency of early fermentation phase. The model was proved to be effective and with good prediction capacity. By increasing inoculum and changing medium carbon source, the productivity of cephalosporin C fermentation was further increased by 118% and 157%, respectively, which was well predicted by the established model.

　　KEY WORDS Cephalosporin C; Back propagation; Neural network model; Prediction

　　实现发酵生产过程的优化操作和控制，单凭经验或经典的试验数据是无法满足要求的，因此有必要建立模型指导发酵过程的优化，一些难于在线检测的重要变量、如菌体浓度，底物浓度和产物浓度等可借助于已建立的数学模型，通过测量与其相关的其它可在线测量的变量，如尾气中的氧和二氧化碳的含量、发酵液的温度、pH和溶氧浓度的变化等，得到在线的最优化估计。产黄头孢霉(Acremonium chrysogenum)生长与头孢菌素C合成的数学模型最早是由Matsumura提出来的，建立了头孢菌素C合成与形态分化，内源甲硫氨酸诱导头孢菌素C合成与葡萄糖代谢物阻遏效应的结构离散型(segregated)模型［1］。鉴于抗生素发酵难以建立精确的数学模型，无需精确模型的智能控制策略在抗生素发酵过程控制中得到了应用。基于误差反向传播(back propagation，BP)算法的多层前向神经网络(BP网络)已广泛用于发酵工业的培养基优化，连续搅拌反应器神经网络估计，分批发酵及补料分批发酵过程建模与控制优化［2～5］。Cruz等建立模型描述葡萄糖与蔗糖的利用速率与头孢菌素C的合成的关系，利用神经网络以早期的菌浓预测整个发酵过程的菌量［6］。Sliva等运用杂交神经网络，根据在线检测尾气中二氧化碳和氧的浓度，预测Cephalosporium acremonium发酵过程的菌体浓度，估计细胞的生长速率、底物的消耗速率和产物的生成速率［7］。李运锋等利用基于神经网络的滚动学习预报技术，实现了头孢菌素C产量、产物质量浓度和效益函数的超前预报，为发酵过程的动态控制和调度优化提供了支持［7，8］。 有关头孢菌素C的合成已建立了很多模型，而且用发酵早期的菌浓进行预测也已有研究， 但只用发酵早期的菌浓预测后期的菌量，并没有与产物合成关联起来。在头孢菌素C发酵过程放大的研究中，发现菌体早期的生长与产素的关系密切，因此本文采用BP神经网络技术利用发酵前期的大量数据建立效价的预估模型，实现了对头孢菌素C效价的预测，同时将该模型应用于生产实际。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　1.1.1 菌种 产黄头孢霉(Acremonium chrysogenum)AC0508由山西威奇达药业集团提供。

　　1.1.2 培养基(%) 糊精50，玉米浆70，豆油10，DL蛋氨酸06，KH2PO4 04，(NH4)2SO4 08，FeSO47H2O 0005，CaCO3 10，消前pH62。

　　1.1.3 发酵罐 50L发酵罐的搅拌桨为六直叶(直径12cm)，三层，d/D=036，层间距12cm，搅拌桨叶尖线速度为1256～4082m/s；160m3发酵罐的搅拌桨四层，六直叶涡轮式搅拌桨，d/D=0375，搅拌桨叶尖线速度为518～848m/s。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 总糖和还原糖的测定 斐林试剂法［9］。

　　1.2.3 尾气分析 尾气分析使用VG Prima dB型质谱仪，最后的数据处理、通讯和相关分析通过华东理工大学国家生化工程技术研究中心自行开发的上位机软件包《发酵过程检测系统B10RADAR 2.0》完成［10］。

　　1.2.4 头孢菌素C效价测定方法 HPLC法。色谱柱为TSKgel ODS100S(46mm×250mm，10μm)；流动相20mmol/L乙酸铵缓冲液(pH56)∶乙腈(94∶6)，流速10ml/min，紫外检测波长254nm，室温，进样量20μl。

　　1.2.5 菌丝浓度测定 湿菌体(PMV)采用离心法计算，取10ml发酵液，3000r/min离心15min，计算固形物体积占发酵液的比例。

　　1.2.6 发酵培养方法 三级发酵。一级种子(种龄76h)→二级种子(种龄40h)→发酵，一级种子接入二级种子的接种量为10%，二级种子接入发酵的接种量为17%；通过压差法接入，发酵过程培养130～150h左右，培养温度40h之前28℃，40h后控制为25℃。发酵过程控制根据实验情况调整。补料用硫酸铵、豆油等各自分消，根据需要独立补入。

　　2 结果与分析

　　2.1 网络构建与模型检验在BP网络预估模型的建立中共选取23批发酵161组数据作为样本，其中18批发酵的126组数据作为学习样本，5批发酵的35组数据作为检验样本(Tab.1, Tab.2)。建立三层神经网络，三层网络的结构由输入层、隐层和输出层组成。由于固定了输入节点和输出节点的个数及各层数据处理函数，所以隐层节点数目将决定网络性能。在训练网络的过程中，为了获得最好的训练精度，依次选取1至20个隐层节点数。经过20000次训练后，得到其相应的误差平方和(Sum Squared Error，SSE)选取SSE最小的节点进一步训练，得到最优隐层节点的个数是2。然后对此BP网络再进行60万次训练，最终使其SSE达到00542，相对误差为419%。由此建立的BP网络结构(Fig.1)由6个输入节点、2个隐层节点、1个输出节点构成。6个输入节点(x1～x6)依次代表20、36、44、52h的菌浓(%)，发酵前期pH最高点与最低点的数值；输出节点y为60h效价(u/ml)。为检测上述建立的神经网络的预测能力，BP网络训练完成后，用剩余的五组数据(冗余数据)进行验证，所得验证结果如Tab.2所示，SSE为00077，相对误差分别为-07323%、15599%、-71026%、-55068%和-20026%。

Tab.1 （略）

　　Tab.2 （略）

　　2.2 模型应用通过神经网络模型预测，表明发酵前期菌浓与pH值的变化是决定效价的关键因素，前期菌浓较高，pH值变化幅度较大效价则较高。通过建立神经网络模型，能够利用发酵前期菌浓定量地预测效价，为进一步优化产素水平提供依据。任何能够引起前期菌浓与pH变化的因素都将影响到效价的高低，比如种子的质量、培养基的配比及其消毒温度、剪切环境、 培养温度等。

　　Fig.1 Topology of BP neural network（略）

　　发酵前期pH的变化反映了菌体的代谢活性，未加调控，因此实际操作上考虑从提高菌浓的角度来提高产素水平。

　　2.2.1 通过倒种增加接种量 增大接种量是提高菌浓的有效、快捷的方法，但由于种子罐的体积已定，无法通过加大种子培养液的体积来增大接种量，因此选择通过倒种增大接种量，在生产实践中检验模型的预测能力。将对照与倒种的罐批发酵前期的菌浓与pH的最高值和最低值输入模型，预测60h的效价，结果见Tab.3，相对误差为25687%和-93267%，通过倒种法60h效价比对照提高了353%，放罐时效价为33773u/ml，比对照提高了118%。

　　2.2.2 改变培养基碳源――葡萄糖代替糊精50L罐上发酵生产头孢菌素C 倒种法虽然是提高菌量的有效方法，但在实际操作中增大了染菌的风险，因此根据摇瓶实验的结果(数据未列出)，在50L罐上考察葡萄糖部分替代糊精后头孢菌素C的合成，以2%葡萄糖3%糊精代替原配方的5%的糊精，结果见Fig.2，在发酵前期pH迅速下降，下降后有两次反弹，最高值620，最低值56，62h后pH通过流加氨水控制在550。RQ值的变化反映了底物利用的转换，25h之前以葡萄糖和玉米浆中的还原糖为碳源，RQ值在09左右，之后以糖和豆油为混合碳源，表现在RQ值较之前降低，80h后完成糖与油利用的转换，完全以油为碳源，RQ值稳定在06～07之间直到放罐。整个发酵过程DO都控制在30%以上，不存在氧限制问题。将对照与葡萄糖代替糊精的罐批早期的菌浓和pH数据输入模型进行预测和验证，结果见Tab.4，相对误差分别是26876%和52653%。
　　
　　Tab.3 （略）

　　Fig.2 （略）
　　
　　Tab.4 （略）

　　在预测过程中会出现误差偏高。网络预测存在偏差是因为微生物的生长和代谢活动紧密相联，发酵过程非常复杂，影响因素很多，培养基的配制、消毒过程，以及参数的检测等都有可能产生偏差。此外，神经网络模型的建立是基于已有数据的基础上，通过多次的训练、学习得到的最优化结果，样本数据的类型决定了模型的预测能力，从现在的结果看，无论是通过倒种还是用葡萄糖部分替代糊精，由于菌浓与效价的增长很大，实际数据与建立模型的样本数据差别较大，这可能是造成模型预测偏差比较大的主要原因，需要进一步补充新的样本数据，对模型进行继续优化，不断提高效价预测的精度。分别对两种碳源发酵过程的菌浓、效价、前期pH和RQ值进行比较分析，结果见Fig.3。葡萄糖代替糊精促进了前期菌的生长，菌量增长优于仅以糊精为碳源的罐批，37h时前者菌浓为38%，后者只有30%，培养基中碳源不同，对菌体的形态和代谢造成很大的影响，pH的变化幅度也不同，代谢活跃的罐批，比如葡萄糖代替糊精的罐批产生大量的有机酸，pH值下降的比较低，开始pH自动控制的时间早，镜检观察到葡萄糖代替糊精后细长菌丝数量增多，为进一步菌丝膨大产生大量的粗短菌丝断片奠定了基础，因此葡萄糖代替糊精后，不论在生长期还是产素期菌浓都比较高。RQ值的变化体现了头孢菌素C发酵过程中不同碳源的利用情况，可分为三个阶段：60h之前以葡萄糖等易于利用的糖为主要碳源阶段；60～80h为糖和豆油两种碳源混合利用及其转换的过渡阶段，80h后完全以豆油为碳源阶段。两种培养基RQ值的差异主要表现在60h之前与60～80h之间这两个阶段，30h之前RQ值有一峰值，葡萄糖代替糊精的罐批由于培养基中有较多葡萄糖，RQ值的这一峰值出现的时间比仅以糊精为碳源的罐批晚；60～80h以葡萄糖代替糊精的罐批先是糖和油被同时利用，之后平稳过渡到完全用油，从用糖到用油期间没有迟滞期；而仅以糊精为碳源的罐批在糖耗尽开始利用油之前有一迟滞期，表现在60h的RQ值比较高(09)，而且在70～90h间有一平台期。结构表明以葡萄糖代替糊精后不仅促进了菌体的生长，还能够实现糖与油利用的平稳过渡。产素水平在60h时效价就已出现差别，葡萄糖代替糊精的效价为9556u/ml，糊精为唯一碳源的效价为7571u/ml，60h后随着培养时间的延长，效价的增长趋势不变，放罐时前者的效价为39170u/ml，后者为33852u/ml，以葡萄糖代替糊精后效价提高了157%。即前期的较高菌浓决定了较高的起步效价，并决定了最终的放罐效价。

　　3 结论

　　建立了神经网络模型，以发酵前期的菌体浓度和pH对60h的头孢菌素C效价进行预测，该模型能够很好地预测效价，表明发酵前期的菌浓和pH变化对头孢菌素C的效价起重要作用， 模型简单实用， 对实际生产有很大的指导意义。应用该模型于实际生产，通过倒种加大接种量的方法提高发酵前期的菌浓，能够提高发酵效价11.8%；另外通过改变培养基的成分，以葡萄糖部分替代糊精也能促进发酵前期的菌浓的增长，达到提高产量的目的(效价提高157%)。将来可进一步考虑改变培养基的消毒方法，如以连消代替实消减少消毒温度过高对培养基营养成分的破坏作用。菌浓增加后发酵液的黏度增大，可能会带来供氧与传质的问题，在实际生产中要加以考虑，提高菌浓应以不造成产素期供氧限制为限。

　　Fig.3 （略）

　　参考文献