应用响应面法优化武夷菌素发酵培养基
2007-09-07 14:27:32   来源：本站原创   评论：0 点击：

武夷菌素是从不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyeesahygroscopicusvar.wuyiensi:)发醉代谢产物中
产生的一种具有胞昔骨架的核昔类抗生素川，可有效防治黄瓜白粉病、番茄灰橄病等多种作物的真菌病
害.该药剂在我国已投人工厂化生产，但是，目前工厂化生产中使用的武夷菌素产生菌效价较低，导致药
剂的生产成本高和产品缺乏市场竞争力等问题.通过选育高产菌株和改进发醉工艺是目前解决以上间皿的
关键.
响应面法(Responsesurfaeemethodology，RSM)是数学方法和统计方法结合的工程优化方法，主要用
于对所感兴趣的响应受多个变t影响的问题进行建模和分析，其最终目的是优化该响应值.RSM的应用领
域不仅局限于化学工业，在生物学、医学以及生物制药领域都得到了广泛应用图.本研究的目的是应用
RSM对武夷菌素发酵培养墓中有关各种营养成分用t进行优化，以获得不吸水链霉菌最优培养基，进而提
高其武夷菌索效价.
1材料与方法
1.1，株
生产菌为不吸水链雄菌武夷变种(5.ahygroscoPicu:va:.w“扒en，is)经诱变后得到的高产菌株540
(采用原始培养基发醉其武夷菌紊效价可达4443拌g/mL)，以枯草芽抱杆菌(Bacilluss“btili，)为指示菌侧
定武夷菌素的效价.2个菌株均由中国农业科学院植物保护研究所生物农药组提供.
1.2培养甚和培养条件
1.2.1培养基
菌种培养采用的是酵母膏葡萄糖培养基[3j;生物测定采用的是经过改进的PDA培养基[s]，其中琼脂
为79/L，原始发酵培养基为淀粉109/L、葡萄糖159/L、玉米粉309/L、豆饼粉209/L、化合物A和B
各39/L
1.2.2培养条件
将保存于甘油管中的抱子接到茄形瓶中的酵母膏葡萄糖培养基上，28℃恒温培养5一7d.然后将茄形
瓶中菌种切成1cmZ大小的菌块，接种到发酵培养基上，28℃，220:/min摇床培养72h.
1.3效价的测定
采用上述PDA培养基，用管碟法中的剂量法[4j测定武夷菌素的效价.
1.4实脸设计
1.4.1培养基关健因子筛选
本实验利用部分因子设计法(FraetionalFaetorialDesign，FFD)[5〕对淀粉、葡萄糖、玉米粉、豆饼粉、
化合物A、化合物B、化合物C、MgSO;、FeSO;、NaCI共10种营养成分的主效应进行考察，以筛选影响
武夷菌素效价的关键因子.
1.4.2搜索重要影响因子的最优范围
根据部分因子设计法所得的结论，采用最陡爬坡法〔2〕对关键因子进行考察.关键因子以部分因子实验
中的一1水平为出发点，0.6%的浓度为步长，非重要影响因子取o水平值，考察发酵液效价变化趋势，通
进最大响应区域，确定重要影响因子的最优范围.
1.4.3关健因子浓度优化
筛选出影响武夷菌素效价的关键因子后，根据JMP软件中的响应面设计模块程序，采用二因素五水平
(共13组实验)的中心组合设计法(CentralCompositeDesign，CCD)对关键因子进行优化，其中关键因子
各取5个水平值，非关键因子取O水平值.根据实验所得数据进行二次多项式的回归拟和，预测武夷菌素
效价最大值及其所对应的关键因子的浓度[6，’〕.
1.4.4响应面模型的脸证
以多元二次方程所预测的最佳培养基为发酵培养基，进行3组发酵实验，以验证模型的有效性.
1.5数据处理与分析
实验设计、数据处理、回归模型分析与数据作图等均是采用JMP软件包(version5.1.2，SASInstitute
Ine.)〔吕〕完成的.
2结果与分析
2.1部分因子设计法筛选培养基中的关锐因子
采用部分因子设计法进行20组发酵实验，筛选对武夷菌素效价有显著影响的因子，其实验设计和20
组发醉实验所得的武夷菌素效价见表1.对表1所列数据进行回归分析得到的结果见表2.所得的回归方
程为:
Y=2983.43+61.08X:+662.32X:一101.32X3+344.32X‘一41.30XS一47.78X6
+46.67X7一40.72Xs+182.86X。一31.64Xlo(RZ=0.8434)
该回归模型中Y为武夷菌素产生效价，Xl、XZ……、xl。分别为培养基10种成分(淀粉、葡萄糖、玉米
粉、豆饼粉、化合物A、化合物B、化合物C、MgSO;、FeSO;、NaCI)的t值.由决定系数R，可知武夷菌素
效价变化中84.34%能被回归方程所解释，(尸>F)=0.013说明回归方程是显著的.在考察的10种营养成
分中，t检验为P<0.05的因素只有葡萄搪和豆饼粉，说明它们的浓度变化会显著的影响武夷菌素的效价，
其它因索则影响不显著.由此确定葡萄糖和豆饼粉为影响武夷菌素效价的关键因子.
 

2。2最陡施坡法确定关健因子的最优范圈
在实验中变化葡萄糖和豆饼粉的浓度以通进武夷菌素效价最大值(表3).由实验结果(表3)可以看出，
随着葡萄糖和豆饼粉浓度的增加武夷菌素效价变化趋势先上升后下降，葡萄糖在269/L、豆饼粉在289/L
浓度范围内武夷菌素效价有最大值，因此在该浓度附近选择中心组合设计的O水平值.
2.3晌应面法优化关扭因子
根据2.1和2.2实验数据结果，采用2因素5水平的中心组合设计法对葡萄糖和豆饼粉浓度进行优
化，共进行了13组发酵实验，其实验设计方案和各组实验所得的武夷菌素效价见表4.采用JMP软件对
表4进行二次多项式的回归拟和，建立武夷菌素效价对葡萄糖和豆饼粉的动态关系响应模型:
Y=6643.78+687.42XZ+275.13X;一824.69XzZ一122.45X2X;一620.94X;2(RZ=0.8999)
式中Y为武夷菌素效价的预测值，XZ和X;分别为葡萄糖和豆饼粉的量值.回归方程的方差分析(表5)结
果(P>F)一0.0022，表明模型在a~0.01水平上显著;决定系数r一0.8”9，说明仅有约10%的武夷菌
素效价变化不能由该模型所解释，由此认为回归模型拟合程度很好.对该方程求偏导得出:当XZ=0.40，
X;~0.18时，Y有最大值6807，经编码转换后得:x:=27.2，x;一31.8.由此得到5-40菌株产武夷菌素
最优培养基配方为:淀粉89/L、葡萄糖27.29/L、玉米粉209/L、豆饼粉31.89/L、化合物A3.29/L、
化合物B3.29/L、化合物C0.29/L、MgSO‘0.29/L、FeSO。0.29/L、NaCI0.29/L.
葡萄糖和豆饼粉交互作用对武夷菌素效价的影响可通过响应面图直观反映出，通过图1可知:该方程
存在最大值，且有萄精和豆饼粉存在着协同效应，由于葡萄糖和豆饼粉分别是培养基中主要的碳撅和氮
源，由此可知武夷菌素的合成需要合适的碳氮比.
2.4多元二次方程及优化培养‘的脸证采用模型预测的最优培养基对S一40菌株进行3次发醉实验，以检验模型的有效性.3次实验所得武夷菌素效价分别为6793拌g/mL、6615拌g/mL、6522料g/mL，平均效价为6643拜g/mL，模型方程预侧值和实验验证值的平均相对误差为2.4%.由此可以看出，该模型能很好的模拟武夷菌素效价随2种关键营养成分的变化动态规律.使用该模型推算得到2种主要营养成分的最佳浓度制成的优化发醉培养墓，可以使540菌株产武夷菌素的效价比使用原来的培养墓(4443拌g/mL)提高约50写.

本文采用响应面法对武夷菌素发醉培养基中10种营养成分进行了优化，建立了二次响应棋型，.并对武
夷菌素效价最大值进行了预侧，经过实验验证，预侧值与实际值之间相对误差仅为2.4%，优化后武夷菌
素的效价达到6643拌g/mL，比原来4443拌g/mL有明显的提高.由此可见响应面法与单次单因子法、正
交设计法和均匀设计法等传统的优化方法相比较，实验次数少、周期短，可大大节省时间和成本，而且可以
通过二次方程模型的拟合及方差的分析，评价每个因子及其交互作用对所得产物的影响，快速、有效的预侧多
因子系统的最佳条件，这是传统方法所不能达到的.因此把JMP软件、优化设计和发醉实验相结合，可以更
加科学和快速的优化发醉培养基，降低成本，提高经济效益，是徽生物改进发醉工艺的一种可行的途径.