丝状真菌基因工程研究进展
2007-05-30 22:28:14   来源：《生物工程进展》1999,Vo l. 19,No. 1   评论：0 点击：

　丝状真菌在工业、农业、医药以及基础生物学研究中具有重要作用。例如, 重要的抗生素产生菌—产黄青霉(P en icillium ch ry sog enum )和顶头孢霉(Cep ha losp orium acrem on ium ) 分别能产生青霉素和头孢菌素, 用于疾病的治疗, 而有些丝状真菌又能产生对人体有害的物质, 如黄曲霉毒素产生菌黄曲霉; 一些工业丝状真菌(如黑曲霉A sp erg illus n ig er 和米曲霉A . ory z ae)被广泛用于生产酶类(如蛋白酶和淀粉酶) 和有机酸(如柠檬酸等) ; 丝状真菌又是重要农作物的致病菌, 并能导致粮食等贮藏过程中的腐败变质, 同时又有一些丝状真菌(如白僵菌、绿僵菌、哈氏木霉等) 可用于作物病虫害的生物防治; 丝状真菌中的构巢曲霉(A . n id u lans) 和粗糙链孢霉(N eu rosp ora crassa) 由于其相对简单性而被作为“模式”种用于真核生物的一些基础生物学特性研究。由于丝状真菌在经济上和科学中的重要性, 多年来一直被广泛地研究, 以便了解和控制其有益和不利性状。

　基因工程首先在原核生物—细菌中获得成功, 这大大地激励了许多科学家将这一技术应用到丝状真菌的研究中, 目前丝状真菌的遗传转化(基因工程) 在理论上和应用上均取得了较大的进展, 本文评述了转化的丝状真菌种类及选择标记, 丝状真菌的复制型转化和整合型转化, 丝状真菌摄取外源DNA 的方法途径, 丝状真菌转化子的遗传稳定性以及丝状真菌基因工程的应用等内容。

1　转化的丝状真菌种类与选择标记

111　转化丝状真菌种类

第一个被转化的丝状真菌是由M ish ra 和Tatum 于1973 年报导的粗糙链孢霉[ 1 ] , 他们用来自野生型菌株的总DNA 处理肌醇缺陷型菌株获得了肌醇原养型转化菌落, 但当时尚没有可利用的分子技术对转化子进行鉴定, Case等[ 2 ] 于1979 年首次证实了DNA 介导的粗糙链孢霉的遗传转化, 他们证实在转化子中含有整合于染色体上的质粒DNA 片段, 随后, 在越来越多的丝状真菌中实现了遗传转化, 据作者不完全统计, 截止到1995 年已有90 余种丝状真菌转化成功, 其中有许多种类可被具有不同选择标记的多种载体所转化。已转化成功的丝状真菌中有工业真菌(如黑曲霉、米曲霉等)、医用真菌(如产黄青霉、顶头孢霉)、植物病原真菌(如玉米黑粉菌、小麦全蚀菌等)、杀虫真菌(如白僵菌、绿僵菌)、真菌上寄生真菌(如哈氏木霉)、食用真菌(如裂褶菌、鬼伞等)、菌根真菌(如卷边桩菇、漆蜡蘑等) 等。
112　选择标记。

遗传转化通常是稀有事件, 因此, 从大量的未转化细胞(原生质体) 背景中筛选转化子必须依赖于可供选择转化子的遗传标记, 筛选所希望的转化子通常是将经DNA 处理的样品涂布于琼脂平板培养基上而进行, 筛选策略可基于原养型生长、药物抗性、抗生素抗性或利用报导基因通过视觉而筛选。最初转化的丝状真菌多是利用营养缺陷型菌株而进行的, 通过将野生型等位基因转移到相应的营养缺陷型菌株中, 在基本培养基中筛选原养型生长菌落而得到转化子, 目前, 已用于丝状真菌转化的野生型标记基因有ade (腺嘌呤) (据统计有2 种丝状真菌被转化, 下同)、m et (蛋氨酸, 3 种)、pyr (嘧啶, 17 种)、t rp (色氨酸, 9 种)、n ic (尼克酸, 1 种)、ribo (核黄素, 1种)、arg (精氨酸, 7 种)、len (亮氨酸, 3 种)、p ro(脯氨酸, 1 种)、in l (肌醇, 1 种)、n it (氮, 1 种)、am (谷氨酸脱氢酶, 1 种)、n iaD (硝酸还原酶, 11种)。

然而, 在大多数丝状真菌中难以获得适宜的营养缺陷型菌株, 而且, 根据经验实验, 高产菌株中的任何正向突变均具有无法控制的副作用, 并最终降低产量, 这自然防碍了利用遗传工程改良菌株, 因此利用不需要相应突变型菌株的显性标记(药物或抗生素抗性) 进行遗传转化尤为有用, 最早利用的显性抗性基因是卡那霉素抗性基因(kanR ) , 对卡那霉素或G418 具有选择抗性[ 3 ]。目前利用kanR 实现的遗传转化丝状真菌约有6 种, 利用争光霉素抗性基因(b leR ) (对争光霉素或腐草霉素具有抗性) 实现转化的丝状真菌约有14 种, 利用B2微管蛋白基因(benR ) (对苯菌灵具有抗性) 实现转化的丝状真菌约有18 种, 利用潮霉素磷酸转移酶(hph)基因(对潮霉素具有抗性) 而实现转化的丝状真菌约有62 种, 利用bar 基因( 对双丙磷b ialapho s 具有抗性) 实现转化的丝状真菌1种, 利用邻氨基苯甲酸合成酶基因的显性突变基因( t rp 3iar) (对52氟吲哚具有抗性) 而实现转化的有2 种。另外, 利用am dS 基因(能使转化子在以乙酰胺为唯一氮源中生长) 而实现转化的丝状真菌约有12 种, 寡霉素抗性(o liR ) 作为一种半显性抗性具有种的特性, 因而其应用受到限制。用于丝状真菌转化的报导基因有E.co li B—— 半乳糖苷酶基因( lacZ) [ 4 ]、E. coli B2葡糖苷酶基因(GU S) [ 5 ]。利用报导基因可通过与指示化合物的显色反应而视觉检测导入的基因所编码的酶活性, 并可对其表达水平定量化,同时, 还可利用融合有报导基因的载体获取启动子序列, 并比较其启动子效率高底。
2　外源DNA 导入丝状真菌受体的方法
外源DNA 导入丝状真菌中最普遍使用的方案是CaCl2ˆPEG 介导的原生质体转化[ 6 ]。首先是用溶壁酶处理菌丝体或萌发的孢子获得原生质体, 然后将原生质体、外源载体DNA 混合于一定浓度的CaCl2、PEG (聚乙二醇) 缓冲液中进行融合转化, 若去掉PEG 则无转化发生,然后, 将原生质体涂布于再生培养基中选择转化子。

对于难于获得原生质体的丝状真菌来说,也可利用醋酸锂介导的完整细胞的转化, 醋酸锂的最佳浓度为011M , 但这种方案在改进转化方面并无内在优势, 尤其对整合转化而言。在丝状真菌中也应用了电转化技术, 与普遍采用的CaCl2ˆPEG 方法相比, 虽然简化了操作步骤, 但对提高转化率并无明显作用。基因枪注射(或生物导弹) 转化技术[ 7 ] , 最近几年也在丝状真菌中得到应用, 这一方案需要专门的设备和包埋转化DNA 的微粒, 它同样不能十分有效地提高转化率, 但对于实验室条件下不能良好培养的或不能获得足够数量的再生原生质体的丝状真菌尤为有用, 如利用基因枪轰击已成功地实现了两种专性植物病原真菌的转化[ 8 ] ,Radfo rd (1981) [ 9 ]还利用人工制备的含有转化DNA 的脂质体转化粗糙链孢霉的原生质体, 但这种方案并不比CaCl2ˆPEG 或其它转化方案优越, 因而仅应用到少数几种真菌中。

3　丝状真菌的复制型转化和整合型转化
转化DNA 进入寄主细胞后, 可独立于寄主细胞核染色体外而自主复制(复制型转化) ,或整合到寄主染色体上而随寄主染色体一道复制(整合型转化)。
311　复制型转化
复制型转化需要构建含有真菌复制子的复制型载体, 已从卷枝毛霉(M ucorC ircinelloid s ) , 布拉克须霉( P hy comy cesblakesleea nus)、米曲霉(A . ory z ae)、玉米黑粉菌(U. m ay d is) 等多种丝状真菌的线粒体DNA或基因组DNA 中分离到自主复制顺序(ars) ,最初人们做了大量工作试图在体外构建构巢曲霉和粗糙链孢霉的自主复制载体, 但没有检测到载体的自主复制[ 6 ] , 后来,David 等(1991) [ 15 ]成功地构建了构巢曲霉自主复制型载体ARp 1; T sukuda 等(1988) [ 10 ] 将玉米黑粉菌的ars 插入到整合型载体中成功地构建了复制型载体, 它能在黑粉菌细胞中自主复制, 并使转化率高达10, 000 个ˆLg DNA; 另外, 在柄壳孢(P od osp ora anserina)、布拉克须霉等丝状真菌中也实现了自主复制质粒的转化。

除了在体外构建自主复制载体外, 也可在丝状真菌体内获得能自主复制的重组质粒, 这是通过非复制型载体与染色体DNA 或线粒体DNA 整合, 获得受体菌能自主复制的顺序而形成重组质粒, 这种重组质粒具有自主复制能力,目前, 已在灰绿犁头霉(染色体DNA 与非复制型载体的重组)、构巢曲霉(染色体DNA 与非复制型载体的重组)、尖镰孢(染色体DNA 的端粒顺序与非复制型载体的整合)、糙皮侧耳(染色体DNA 与非复制型载体的组)、花药黑粉菌(线粒体DNA 与非复制型载体的重组)等丝状真菌体内获得复制型重组质粒。

312　整合型转化:
已实现转化的丝状真菌中, 绝大多数都是整合型转化, H innen[ 11 ]将酵母菌的整合转化分为三种类型, 在丝状真菌中同样存在这三种类型。第一种类型为转化DNA 与受体染色体同源序列之间的重组, 通过单交换导致转化DNA整合到染色体DNA 上。第二种类型是转化DNA 与受体染色体的异源重组, 通过单交换导致转化DNA 整合到受体染色体上。含有异源序列的载体和含有同源序列的载体均可产生异源重组, 但含有同源序列的载体与受体染色体发生异源重组的比例较少。第三种类型是转化DNA 与受体染色体同源重组, 通过双交换导致转化DNA 中的基因取代受体染色体中的基因。三种类型发生的频率随菌株, 甚至选择标记的不同而异, 但在丝状真菌中, 第二种类型的异源整合转化是常见的, 这明显不同于酵母菌, 丝状真菌的异源整合转化可能不需要广泛的序列相匹配(m atch ing) , 因为整合连接处的核苷酸序列很少或没有同源性(Razanamparan) 等[ 12 ] ,不过, 有关异源整合所需的最低程度的同源性尚未确定, 这可能由于菌株或标记的不同而不同, 也可能受目前尚不清楚的重复弥散顺序的分布的影响。总而言之, 整合转化受多种因素影响, 如序列同源性的程度、转化DNA 的构型、特异性选择标记、被转化的菌株种类、以及尚未确定的影响DNA 断裂和修复的特异性基因及其产物的活性等。

4　丝状真菌转化子的遗传稳定性:
411　整合型转化子无性繁殖稳定性:
转化子的遗传稳定性是其应用的一个主要标准, 整合型转化中由于转化DNA 整合到染色体DNA 中, 因此其稳定性应如同任一染色体基因一样稳定, 但事实并非总是如此。已有的研究表明, 转化子中的转化DNA 片段在有丝分裂过程中是十分稳定的,Boylan 等(1985) 的研究表明构巢曲霉的argB 基因在50 代以上的生长过程中仍未检测出丢失发生、Bei 等(1991) 的研究表明, 花药黑粉菌(U stilag o v io2lacea ) 的抗潮霉素转化子在无选择压力的情况下生长30 代, 所检测的转化子中百分之百是有丝分裂稳定的, JunW ang 等(1988) [ 13 ]分别检测了3 个… 型整合和3 个型整合的转化子中的转化DNA 稳定性, 他们将每一转化子纯化的菌落在不含潮霉素B 的液体完全培养基中培养约30 代后, 涂布在不含HygB 的完全培养基平板上, 将所得到的菌落分别转接种到选择和非选择培养基中, 检测其对HygB 的敏感性, 每一样品中所检测的200 个菌落均保持了HygB抗性表型, Chen 等[ 14 ] (1993) 发现整合到粟疫菌中的病毒cDNA 可通过分生孢子无性繁殖而得到维持, 分生孢子得到的菌落也可检测到来自cDNA 的细胞质L 2dsRNA。M igheliQ 等( 1994 ) 发现哈氏木霉( T richod erm aha rz ianum ) Hyg B 抗性转化子在无选择压力情况下营养生长几个循环后, 以及在西红柿植株上生长2 周后, 所有转化子均未丧失HygB抗性, 尽管绝大多数研究表明整合转化具有有丝分裂稳定性, 但JohnM. J 等(1985)、U p shallA 等(1986) 研究报导有50% 以上的arg B+ 标记丢失。转化子的遗传稳定性可能也与转化方法有关, Lo rito M. 等[ 7 ] (1992) 报导生物导弹(B io list ic) 转化法所得到的哈氏木霉和绿粘帚霉的抗潮霉素转化子后代遗传稳定性高于PEG 介导的原生质体转化。

412　整合型转化子有性繁殖稳定性
转化子的减数分裂遗传稳定性通常是不规律的, 有的研究没有检出转化DNA 的丢失, 而有的研究表明转化DNA 丢失达36% 以上, JunW ang 等[ 13 ] (1988) 检测了玉米黑粉菌518 菌株的4 个潮霉素抗性转化子分别与野生型菌株521 的杂交结果, 从每一杂交获得的200 个担孢子中, 一半对HygB 具有抗性, 一半没有抗性, 分别对6 个具有抗性和没有抗性的减数分裂分离物进行Sou thern 杂交发现, 在无抗性分离物中没有发现杂交信号, 而在抗性分离物中,质粒整合模型与最初的亲本转化子相比没有发生变化, 这表明转化DNA 可通过有性繁殖而传递;A rnan 等(1993) 在研究诱导黄枝孢(C la2d osp orium f u lvum ) 准性生殖循环中转化DNA的遗传时发现85 个后代中, 有80% 的后代含有载体顺序, 其中含载体顺序的后代中, 有70% 的后代对HygB 具有抗性, 有8 个后代的hph 基因失活, 失活的原因是由于载体顺序的重新排列, 而与重复诱导点突变无关( repeatinduced po in t m u tat ion, R IP ) , Chen 等(1994) [ 14 ]发现整合的病毒cDNA 拷贝能忠实地传递到粟疫菌子囊孢子后代中, 并从子囊孢
子中获得的菌落发现含有来自cDNA 的细胞质L 2dsRNA。
413　复制型转化子的稳定性
David 等(1991) [ 15 ]研究了构巢曲霉自主复制转化的转化子无性繁殖遗传稳定性, 在无精氨酸培养菌中生长的转化子所形成的分生孢子中, 有65% 的分生孢子丢失转化DNA , 成为A rg- ; 将A rg+ 转化子在无arg 培养基中连续培养12 代后, 发现后代A rg+ 表型仍不稳定,A rg+ 后代的比例为35% 到53% , Sou thern 分析表明A rg- 后代均丢失了质粒ARp 1, 在两个argB+ 转化子分别与argB2 缺陷型菌株进行有性杂交时发现, 30- 61%的后代是A rg+ , 这表明ARp 1 可通过有性循环而传递; Bu rm ester等(1992) 发现含有SEG1 的自主复制质粒转化的A bsid ia g lanca 有丝分裂非常稳定, 可传递到无性孢子后代中, 其原因可能是SEG1 中含有与质粒分配和稳定分离有关的结构因素。

5　丝状真菌基因工程的应用展望
511　在农业上的应用:
基因工程为从分子水平上探讨病原真菌对植物的致病机理, 并为最终控制病害提供强有力的手段,W elt ring 等(1988) [ 16 ]从豌豆病原真菌—N ectria haem a tacocca 中分离到控制其致病性的基因—豌豆素脱甲基酶(PDA ) 基因, 豌豆素是豌豆产生的对该病原菌有毒性的化合物, PDA 基因所编码的酶能解除豌豆素对N .haem a tacocca 菌株的毒性, 从而导致寄主植物豌豆感病, 缺乏豌豆素脱甲基酶活性的N .haem a tacocca 菌株则无致病性, 通过转化将PDA 基因导入非致病性菌株中而得到的转化子则具有致病性, 这表明PDA 是该病原菌导致豌豆感病所必需的; M ichael Bo lker 等(1995) [ 17 ]利用限制酶介导的整合(REM I) 转化从玉米黑粉菌中获得约1000 个插入突变体, 致病性实验表明这些突变体中约有1- 2% 的突变体不能诱导植物产生病症, 已证实其中两个突变体表型与插入事件有关, 这两个非致病性突变体的发现表明分子遗传学可被用于研究致
病发育过程中的复杂过程。
基因工程也为提高杀虫真菌的应用潜力提供了广阔的前景, Goet tel 等[ 18 ] 将抗苯菌灵的B2微管蛋白基因(benR ) 导入绿僵菌中得到抗苯菌灵的转化子, 其抗性比原来的受体菌株提高了10 倍, 从而为绿僵菌与杀真菌剂—苯菌灵混合使用而更有效地杀灭害虫提供了可能。基因工程还为病原菌的生物防治提供了有效手段。哈氏木霉是一种潜在的生物防治剂用于防治植物病源真菌, 如疫霉菌、丝核菌、腐霉菌等, 哈氏木霉防治病原真菌的关键是能产生B21162葡聚糖酶以降解病原菌的细胞壁并继而侵入病原菌体内。Lo ra 等(1995) 首次获得编码B21162葡聚糖酶的cDNA , 并在酵母中得到表达, 其降解B21162葡聚糖的能力很强; 植物体内缺乏B21162葡聚糖酶及B21162糖苷键, 若将编码B21162葡聚糖酶基因导入植物体内获得转基因植物并过量表达B21162葡聚糖酶, 对提高植物抗病性将是重要的, 这种转基因植株对植物病原真菌的忍耐力将更强, 并能触发植物更快速的内源应答反应释放B21162葡聚糖酶以部分降解病原真菌的细胞壁; 另外, 具有增强的B21162葡聚糖酶活性的转基因哈氏木霉作为综合生物防治剂也是非常有用的。在粟疫菌(C ry2p honectria p a rasitica ) 内发现的双链RNA(dsRNA ) 可作为潜在的生物防治剂[ 14, 19 ] , 将dsRNA 的cDNA 导入粟疫菌的毒性菌株中,获得的减毒转化子含有整合的病毒cDNA 拷贝和来自cDNA 的细胞质内复制的L 2dsR2NA , 且转化DNA 可稳定地通过分生孢子和子囊孢子而传递, 通过子囊孢子而传递的现象在天然存在dsRNA 的减毒菌株中没有发现, 转化DNA 也可通过菌丝融合而转移到毒性菌株中, 从而提高了粟疫病生物防治的潜力。
512　在工业上的应用:
重要的工业用丝状真菌基因工程为商品化生产酶或其它蛋白质提供了新的途径, 利用丝状真菌生产异源蛋白质具有许多优点, 如①易于识别异源基因的内含子剪切位点, ②具有高的基因表达水平和产物外泌能力, ③具有强的可被广泛识别的启动子, 而且具有大量的工业生产丝状真菌的经验和人类消费习惯, 因此, 由黑曲霉等转基因工业丝状真菌生产的产品可认为是安全产品, 已有研究者利用黑曲霉工程菌商品化生产牛凝乳酶原[ 20 ]。另外, 分别在丝状真菌中表达了溶菌酶、人组织型纤溶酶原激活剂、胰蛋白酶抑制剂等[ 21 ] , 还可利用遗传工程
真菌大量生产特定的酶(如葡糖淀粉酶、纤维素酶、果胶甲基酯酶) 用于食品加工、纸张制造、有机废物处理等[ 22 ]。
513　在医学上的应用:
顶头孢霉和产黄青霉分别是重要的抗生素—头孢菌素和青霉素的生产菌, 基因工程使人们能从分子水平上了解其产生途径及调控机理, 为高产优质生产抗生素提供新的方法途径。Skat rud P. L. (1989) [ 23 ]等利用重组DNA 技术在顶头孢霉中引入一个编码扩环酶的基因ce2fEF 后, 可使头孢菌素C 的产量提高15% ,Can tw ell 等(1992) 将cefEh (编码青霉素N 扩环酶) 和CepDh (编码青霉素N 差向异构酶) 导入青霉素产生菌—产黄青霉中, 从产黄青霉发酵液中分离到头孢菌素的前体deacetoxy2cephalo spo rin C, 从而构建了一个新的合成头孢菌素的途径,Lo rilee 等(1995) 向表达扩环活性的重组产黄青霉中添加已二酸生产出头孢菌素中间产物。利用产黄青霉生产青霉素已有几十年历史, 但对其合成途径及调控仍知之甚少,构巢曲霉同样可产生青霉素, 可做为一个模式种来研究青霉素生物合成的调控, 在构巢曲霉中自氨基酸生物合成青霉素G 由三种酶按顺序进行, 即D2(L 2A2am inodipyl) 2L 2半胱氨酰2D2缬氨酸合成酶(ACV S)、异青霉素N 合成酶( IPN S) 和乙酰CoA: 62氨基青霉烷酸酰基转移酶(AA T ) , 利用重组DNA 技术可以来研究控制青霉素生物合成步骤, Fernandez2Canon 等( 1995) [ 24 ]利用可被生长培养基调控的构巢曲霉alcA (乙醇脱氢酶) 基因的强启动子来驱动ipnA 基因( 编码IPN S) 和acyA 基因( 编码AA T ) 的转录, 并检测这些酶的活性是否限制青霉素的胞外积累, 研究表明虽然实验菌株St rain TR I 的IPN S 酶活性比对照菌株高40倍, 但运输到胞外的青霉素仅比对照提高25% , 菌株St rain TRA 的AA T 酶活性虽然比对照菌株高3- 8 倍, 但却降低了青霉素的生产, 他们的结论认为IPN S 和AA T 酶活性均不限制青霉素的生物合成。N ara 等(1993) [ 25 ]成功地建立了ML 2236B(康派定, Compact in) 产生菌—桔青霉(P en icil2lium citrinum ) 的遗传转化体系, 这为利用重组DNA 技术改良菌株和生产新的ML 2236B 衍生物提供了重要的一步。