多菌种混合发酵猪血的研究
2007-05-26 22:14:43   来源：本站原创   评论：0 点击：

猪血是一种高蛋白、低脂肪、低糖而微量元素含量丰富的食品工业副产品,其蛋白质含量为18%[1],与猪瘦肉相当,故有“液态肉”之称[2,3]。降解猪血可产生一些具有特殊生理功能的生物活性肽。这些生物活性肽在调节胃肠道运动、调节免疫系统、抗高血压、抗血栓、抗菌、抗病毒、抗癌、清除自由基和促进矿物元素吸收等方面发挥重要作用。近年来,对肽在蛋白质营养中的作用越来越受到重视,小肽能被完整吸收的观点也被广大学者所接受[4,5]。然而,我国许多屠宰场屠宰牲畜后留下来的血液除了少部分用做菜肴食用外,绝大多数就直接排放到环境中,既浪费了宝贵的蛋白质资源,又严重污染了环境。目前,利用蛋白酶水解猪血制备多肽研究居多,多数采用AS1.398中性蛋白酶单一或者混合其它的酶进行酶解[6～14]。少数研究采用微生物降解猪血,如米曲霉菌株、黑曲霉菌株、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等[15～19]。自然界中微生物群体之间存在中立、偏利、协作、共生、寄生、竞争、拮抗等相互关系[20]。其中,正相互作用的偏利、协作、共生等关系启发人们采用不同菌株进行混合发酵[21]。现代研究实验证明:不同的微生物有不同的代谢途径,代谢产物各有不同,微生物协同作用能优势互补,相辅相成起到单一菌株起不到的作用[22]。微生物菌群在适宜的环境下大量繁殖,分泌大量的酶,使蛋白质、碳水化合物等大分子营养物质部分分解、转化,蛋白质中不易打开的双硫键被打开,并积累大量的代谢产物[23]。本试验利用一株从自然界分离并经过诱变选育出的高产血红蛋白酶的蜡样芽孢杆菌菌株Lact5.Ⅲ.8与两株产蛋白酶的枯草芽孢杆菌W11、N14以及一株酿酒酵母进行混合发酵猪血研究,为进一步研究工作打下基础。

1　材料与方法

1.1　材料与设备新鲜猪血:湖南农业大学屠宰场采集;玉米粉:市售;蜡样芽孢杆菌Lact5.Ⅲ.8:从畜禽血液污染的土壤中分离筛选并经过紫外和化学结合诱变育种得到;枯草芽孢杆菌(W11、N14)、酿酒酵母:由湖南农业大学食品科技学院微生物教研室提供;细菌斜面培养基:营养琼脂培养基[24];细菌种子培养基:营养肉汤培养基[24];酵母菌培养基:YEPD培养基[25];SS325型高压灭菌锅:上海三申医疗器械有限公司;LRH 250A型生化培养箱:广东省医疗器械厂;AE200型电子分析天平:梅特勒 托利多仪器有限公司;HD 925型超净工作台:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;HZQ Q振荡器:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。1.2　试验方法1.2.1　单菌种发酵试验设计　将活化到第三代的Lact5.Ⅲ.8、W11、N14接种于营养肉汤培养基、酿酒酵母接种于YEPD培养基,在32℃、120r/min条件下培养24h,分别接种于新鲜猪血中,接种量为5%(V∶V)、在32℃、120r/min发酵48h,测定其水解度。1.2.2　菌种配比试验　蜡样芽孢杆菌Lact5.Ⅲ.8接种2%于猪血中,其它菌株接种量进行L9(34)正交试验,结果见表1。在32℃,120r/min条件下发酵48h,测定其水解度。

1.2.3　发酵温度试验　设定不同的温度:27,30,33,36,39℃,其余条件同1.2.2。进行混合发酵的菌株大部分最适pH值为中性,而猪血的自然pH值为7.2,因此本试验过程中没有进行pH值调节,以猪血的自然pH值进行试验。

1.2.4　发酵时间试验　设定不同的发酵时间:36,42,48,52,60,66,72h,其余条件同1.2.2。

1.2.5　添加玉米粉量试验　设定不同的玉米粉添加量:50,100,150,200,250,300,350g/L,其余条件同1.2.2。1.3　测定指标与方法蛋白质含量的测定:凯氏定氮法[26],用P0表示;可溶性氮含量测定:取水解液10mL,加入质量分数10%三氯乙酸10mL,混匀,静置10min后,4℃、3500r/min冷冻离心5min,取上清液凯氏定氮测定含氮量;水解度的测定:凯氏定氮法分别测定猪血发酵前总氮含量以及发酵前后可溶性氮含量,按以下公式进行计算:

1.4　统计分析采用SPSS13.0统计软件分别对单菌种发酵、发酵温度、发酵时间和玉米粉添加量的3次平行试验结果进行最小显著性差异(LDS)方差分析(P<0.05)。

2　结果与分析

2.1　单菌种发酵试验单菌种发酵试验结果及最小显著性差异(LDS)方差分析结果,见表2。

由表2可知,菌株蜡样芽孢杆菌Lact5.Ⅲ.8发酵猪血的能力明显优于其它三株菌株(P<0.05),水解度平均值为6.63%。W11、N14和酿酒酵母分别只有4.60%、4.08%和4.20%,且这三株菌株之间发酵猪血的能力没有显著差异(P>0.05)。前期试验表明;两株枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力都较强,但是分解血红蛋白能力不如诱变蜡样芽孢杆菌Lact5.Ⅲ.8菌株。蛋白酶作用存在专一性,不同蛋白质的结构是不同的,猪血中血红蛋白是以珠蛋白形式存在。因此经过驯化、诱变的蜡样芽孢杆菌Lact5.Ⅲ.8产血红蛋白酶能力明显高于未经驯化、诱变的其它株。2.2　不同菌株配比对发酵猪血的影响W11、N14和酿酒酵母在混合发酵中的菌种配比进行L9(34)正交试验,结果见表3。

　　依据表3中的R值的大小,3个因素对水解度影响依次是A>空列>C>B,即菌株W11是影响水解度的最显著的因素。其接种量的最优组合是A2B2C1,即菌株W11接种量为0.5%、菌株N14接种量为0.5%、酿酒酵母接种量为0.2%。由于该组合正交试验中没有,而试验中水解度最高的组合是A2B3C1,需对这两组试验进行验证,结果见表4。

　　根据验证结果表明:最佳组合A2B2C1所得水解液水解度指标高于正交试验组合A2B3C1,因此,选定最佳组合为A2B2C1,混合菌株发酵猪血水解度比单一菌种发酵猪血水解度分别提高了36.27%(Lact5.Ⅲ.8)、96.45%(W11)、121.14%(N14)、114.83%(酿酒酵母),证明混合菌种发酵猪血的能力高于单一菌种发酵猪血。混合菌种最佳发酵接种量为菌株Lact5.Ⅲ.82%,菌株W11,0.5%、菌株N14,0.5%、酿酒酵母0.2%。2.3　温度对混合菌种发酵猪血的影响在不同温度混合发酵猪血的试验结果及最小显著性差异(LDS)方差分析结果见表5。

由表5可知,不同的发酵温度对水解度的影响存在显著差异(P<0.05),27～33℃随着温度的增加,水解度明显升高,到33℃水解度达到最大值22.61%。随着温度的进一步升高水解度迅速下降,36℃和39℃时水解度比33℃时水解度分别下降了54.8%和64.5%。

2.4　发酵时间对混合菌种发酵猪血的影响发酵时间对混合发酵猪血的影响试验结果及最小显著性差异(LDS)方差分析结果见表6。

由表6可知,水解度随着发酵时间的延长而增加,发酵时间由36h增加到42h,水解度显著增加(P<0.05),从42～54h,水解度的增加不显著(P>0.05),发酵60h水解度迅速上升,60,66,72h三个时间段的水解度增加差异显著(P<0.05)。综合考虑到能耗、生产周期、经济效益及防止发酵液变质等因素,水解时间不宜超过60h。2.5　玉米粉添加量对混合菌种发酵猪血的影响不同玉米粉添加量混合发酵猪血试验结果及最小显著性差异(LDS)方差分析结果见表7。由表7可知,玉米粉的添加量对水解度影响显著(P<0.05),添加玉米粉的样品水解度明显低于空白试验的水解度。当血液中添加少量玉米粉时,水解度减少很明显,50g/L和100g/L的水解度分别只有空白试验的46.95%和45.71%,随着玉米粉添加量的增加,水解度呈明显上升趋势(P<0.05),当添加量达到300g/L时,水解度达到最大9.23%,但仍低于空白试验。

试验中添加玉米粉是为了使酿酒酵母分解其中的碳水化合物产酒精,用酒精的香味来掩盖猪血本身的血腥味。玉米粉的添加使得水解度降低可能是由于酿酒酵母利用碳水化合物产生酒精,对蜡样芽孢杆菌分解蛋白质能力有一定的抑制作用。但随着添加量提高对水解度的影响反而小,可能是酿酒酵母利用碳水化合物后自身生成蛋白质或者肽类物质。3　结论实验结果证明混合菌种发酵猪血的能力高于单一菌种。采用本实验探讨出的发酵条件发酵新鲜猪血,得到猪血多肽产品具有特殊芳香而无猪血本来的血腥味,结果较为满意。本试验采用已验证的安全菌株进行试验,由于混合发酵机理复杂,对于发酵产品的安全性需做进一步研究。