侧胞芽孢杆菌发酵工艺的研究
2007-05-24 21:12:39   来源：中国土壤与肥料　2007(2)   评论：0 点击：

　　侧胞芽孢杆菌(ＢａｃｉｌｌｕｓＬａｔｅｒａｐｏｒｕｓ)属于芽孢杆菌属(Ｂａｃｉｌｌｕｓ),其细胞大小为0 5～0 8×2 5～5 0μｍ,革兰氏染色阳性,可变为阴性,芽孢为椭圆形,侧生、中生或近中生,孢囊膨大,游离芽胞一边比另一边厚(独木舟形)。侧胞芽孢杆菌可促进植物根部有益菌大量生长,抑制病原菌繁殖,促进植物根系生长,增强根系吸收能力,并能活化土壤养分,从而提高作物产量,改善品质,是一种极为有效的微生物肥料[1]。目前,侧胞芽孢杆菌发酵工艺研究报道较少,本试验采用正交设计方法对培养基进行优化,得出了最佳培养基配方;在此基础上进行培养基配方加倍试验,得出了较好的生产配方和发酵条件,提高发酵液中侧胞芽孢杆菌的菌浓度。

1　材料与方法

1 1　供试菌种侧胞芽孢杆菌ＷＹ9701(Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ),广东宏远生物公司提供。

1 2　培养基

1 2 1　斜面培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

1 2 2　发酵培养基基本成分:蔗糖(Ａ)、酵母膏(Ｂ)、蛋白胨(Ｃ)和无机盐(Ｄ)。无机盐成分为ＭｇＳＯ40 03%、ＫＨ2ＰＯ40 1%、ＭｎＳＯ40 004%、ＣａＣＯ30 8%。

1 3　正交试验设计以蔗糖、酵母膏、蛋白胨3种成分为因子,每因子设3个水平,根据Ｌ9(34)表头(表1)设计发酵配方[2]。

　　按照正交设计方案,制备9种试验用配方加无机盐(Ｄ),每个配方3瓶(250ｍＬ三角瓶),每瓶50ｍＬ,包扎,121℃灭菌30ｍｉｎ。冷却后,接种菌悬液。于30℃、220ｒ/ｍｉｎ摇床中振荡培养约48ｈ。培养结束标准为显微镜检查侧孢芽孢杆菌90%形成芽孢。

1 4　无机盐优化配方的筛选在蔗糖、酵母膏、蛋白胨优化的基础上,以ＭｇＳＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、ＭｎＳＯ43种成分为因素,分别以其含量的1、1 5、2、2 5、3、3 5倍配制试验培养基,加入0 8%ＣａＣＯ3,调节ｐＨ至7 2,测定菌浓度。

1 5　液体培养条件的确定采用优化后的培养基,在250ｍＬ三角瓶中,按温度25 0℃、27 5℃、30 0℃、32 5℃、35 0℃、37 5℃,接种量1 0%、1 5%、2 0%、2 5%、3 0%、3 5%,摇床转速140、160、180、200、220、240、260(ｒ/ｍｉｎ),ｐＨ6 50、6 75、7 00、7 25、7 50、7 75、8 00条件下分4组进行实验。

1 6　显微镜检查

涂片用石炭酸复红染色后,在油镜下观察。

1 7　发酵液中有效活菌的测定试验样品在80℃水浴锅中水浴30ｍｉｎ,除去未形成芽孢的杆菌。活菌计数采用混合平板培养法[3]。

2　结果与分析

2 1　优化发酵培养基的确定测定分析结果见表2、表3。通过对Ａ、Ｂ、Ｃ三因素三水平的数据进行方差分析,发现对菌浓度影响的主要因素为Ｃ,其次为Ａ,影响最小的因素为Ｂ。Ａ2Ｂ2Ｃ1水平最合适,即各组含量分别为蔗糖1 5%、酵母膏0 4%、蛋白胨0 6%时最佳。在此配方基础上,做了提高大量元素各成分比例的试验,微量元素含量不变,分别以Ａ、Ｂ、Ｃ含量的1、1 5、2、2 5、3倍配制试验培养基,加入0 8%ＣａＣＯ3,调节ｐＨ至7 2,测定不同水平菌浓度,其试验数据见表4。结果表明,当培养基大量元素各成分浓度加大时,菌浓度提高迅速;但当培养基各成分浓度超过原配方2倍以上时,菌体发生自溶,菌浓度变化不大。因此选择培养基最佳配方为蔗糖3 0%、酵母膏0 8%、蛋白胨1 2%。

2 2　无机盐优化配方的筛选当培养基微量元素各成分浓度加大时,菌浓度提高;但当培养基各成分浓度超过原配方2 5倍以上时,菌浓度变化不大。表5结果表明,培养基配方为蔗糖3 0%、酵母膏0 8%、蛋白胨1 2%,ＭｇＳＯ40 075%、ＫＨ2ＰＯ40 25%、ＭｎＳＯ40 010%时菌浓度最高。

2 3　摇瓶发酵条件的优化2 3 1　培养温度对发酵菌浓度的影响采用优化后的培养基,将已接种摇瓶分别置于温度25 0℃、27 5℃、30 0℃、32 5℃、35 0℃、37 5℃下,200ｒ/ｍｉｎ振荡培养2ｄ,测定发酵液中活菌浓度,图1结果表明,培养温度对菌浓度影响较大,当培养条件为温度32 5℃菌浓度最大。

2 3 2　接种量对发酵菌浓度的影响在优化培养基中,分别接入1 0%、1 5%、2 0%、2 5%、3 0%、3 5%液体菌种,在32 5℃、200ｒ/ｍｉｎ培养2ｄ,测发酵液中菌浓度。图2结果表明,当接种量低于2%时,发酵液的菌浓度和接种量成正比;当接种量高于2%时,接种量对菌浓度的影响可以忽略不计,接种量2%为宜。

2 3 3　发酵液起始ｐＨ对菌浓度的影响分别以5%ＮａＯＨ和ＨＣｌ0 2ｍｏＬ/Ｌ将培养基调节为ｐＨ6 50、6 75、7 00、7 25、7 50、7 75、8 00条件下,在32 5℃、200ｒ/ｍｉｎ培养2ｄ,测发酵液中菌浓度。由图3可知,当ｐＨ值低于7 6时,发酵液的菌浓度和ｐＨ值成正比;当ｐＨ值高于7 6时,发酵液菌浓度和ｐＨ值成反比。因此选择发酵培养基ｐＨ为7 6。

2 3 4　摇床转速对发酵液菌浓度的影响将摇瓶培养基接种后,分别置于转速140、160、180、200、220、240、260(ｒ/ｍｉｎ)下32 5℃培养2ｄ,测发酵液中菌浓度,图4结果表明,当摇床转速在200ｒ/ｍｉｎ时,菌浓度最大。

3　结论本试验通过正交试验和加倍试验对侧胞芽孢杆菌ＷＹ9701菌株发酵配方进行筛选,探讨了培养条件对发酵生产的影响。试验结果表明,侧胞芽孢杆菌ＷＹ9701菌株的摇瓶发酵最佳培养基为蔗糖3 0%、酵母膏0 8%、蛋白胨1 2%、ＭｇＳＯ40 075%、ＫＨ2ＰＯ40 25%、ＭｎＳＯ40 010%,ｐＨ为7 6、接种量2%,最佳培养条件为温度32 5℃、转速200ｒ/ｍｉｎ,所获得发酵液中的所得菌浓度可达9×108个/ｍＬ。对此发酵培养基及培养条件尚须用发酵罐验证,并对通气量进行进一步的研究。