万古霉素修饰磁性纳米粒子的制备及其细菌分离功能
2007-05-10 21:43:27   来源：高等学校化学学报   评论：0 点击：

灵敏即时检测细菌、病毒等病原体对临床医学具有重要的意义,但目前的检测手段在检测低浓度的病原体时通常需要长时间的培养和扩增过程,难以达到即时检测的目的.同时复杂样品中其它组分会干扰或抑制目标微生物的信号.通过超顺磁性纳米粒子的选择性吸附和预浓缩可以克服上述弊端[1～4],有效地提高细菌检测的灵敏性和准确性.万古霉素是一种抗生素,它可与革兰氏阳性菌细胞壁前质末端的D Ala D Ala部分特异性结合[5],Lin等[3]采用万古霉素修饰磁性微球和质谱联用定量分析了微量革兰氏阳性菌.赵庆香等[6]在吸附分离树脂上固定了模拟革兰氏阳性菌细胞壁的多肽类似物,实现了对万古霉素系列抗菌素的选择性吸附.本文制备了万古霉素修饰的磁性纳米粒子,并研究了其对金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coliBL21)的选择性吸附分离特性.
1　实验部分1.1　试剂与仪器　氯化铁(FeCl3·6H2O,A.R.级);硫酸亚铁(FeSO4·7H2O,A.R.级);盐酸(A.R.级);氢氧化钠(杭州化学试剂有限公司,A.R.级);无水乙醇(A.R.级);盐酸去甲万古霉素(Van);γ 氨丙基 三乙氧基硅烷(APTES)(蒸馏后使用);N 3 二甲基氨丙基 N′ 乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(Sigma Aldrich公司);N 羟基琥珀酰亚胺(NHS)(Aldrich公司);钕铁硼磁铁(浙江英洛华磁业有限公司);PBS(0 02mol/L,pH=7 4,自配);金黄色葡萄球(S.aureus)和大肠杆菌(E.coliBL21)(浙江大学动物科学院动医系);三蒸水(自制).透射电镜(JEM 1200EX);傅里叶变换红外光谱仪(BrukerVectro22),X射线衍射仪(D/max rA);Zeta电位仪(Zetasizer3000HSA);物理性质测量系统(PPMS)(PPMS 9magnetometer).1.2　Fe3O4磁性纳米粒子(MNP)的制备　采用共沉淀法[7]制备MNP.在剧烈搅拌下,向除氧的NaOH水溶液(0 5mol/L)中滴加除氧的0 02mol/LFeCl3·6H2O,0 01mol/LFeSO4·7H2O和0 4mol/LHCl的混合液,同时通氩气并超声分散,滴加完后,继续搅拌30min.反应结束后,用磁铁分离出黑色沉淀,用三蒸水洗涤3次,用0 01mol/LHCl洗涤1次,分散在三蒸水中.1.3　Fe3O4磁性纳米粒子的表面氨基化(MNP APTES)　参照文献[8]方法,用硅烷偶联剂APTES对MNP进行表面氨基化.取Fe3O4纳米粒子50mg,用无水乙醇洗涤3次,然后分散在50mL无水乙醇中,向其中加入1mLAPTES及0 5mL三蒸水,超声分散5min,于60℃振荡反应20h.停止反应后,分离出粒子,分别用无水乙醇和三蒸水洗涤3次,分散在三蒸水中.1.4　Fe3O4磁性纳米粒子的表面万古霉素修饰(MNP APTES Van)　取氨基化后的Fe3O4磁性纳米粒子约45mg,分散在pH=5 0(用盐酸调节)的三蒸水中,向其中加入45mg盐酸去甲万古霉素、30mgEDC和9mgNHS,超声5min,室温振荡反应24h.停止反应,将分离出来的上层清液以及用三蒸水第一次洗涤后的上清液,用紫外 可见分光光度计(UV 2550,Shimadzu)测定盐酸去甲万古霉素的浓度.1.5　细菌的分离检测　将培养了12h的金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coliBL21)用PBS稀释到合适的浓度,在4℃,5000r/min下离心10min,再分散涡旋在PBS中,重复3次.然后取纯细菌悬液(记为样品1)10mL加入到100μLMNP APTES Van(记为样品2)中,在25℃,200r/min下的恒温振荡器中振荡10min,然后用Ultrospec3300pro测600nm处的光密度(OD)值,将样品2是从恒温振荡器中取出,然后用磁铁分离,5min后取上层清液测OD值.2　结果与讨论2.1　Fe3O4纳米粒子的表征　TEM检测显示所制得的Fe3O4纳米粒子大小在10nm左右.动态光散射粒径分析结果显示,稀酸处理前纳米粒子的平均粒径为107 4nm,表明纳米粒子存在严重的团聚,经稀酸处理后的平均粒径为43 9nm,说明纳米粒子的团聚得到改善[7],这与制备时较低的铁盐浓度及制备后用稀酸处理有关,Zeta电位测试结果表明,稀酸处理后的纳米粒子表面带正电荷,有利于纳米粒子的分散并明显增加其稳定性.XRD结果表明,所制得的Fe3O4纳米粒子为反式尖晶石结构,并且峰的位置及强度与标准Fe3O4的XRD数据非常吻合,证明了所制得的是Fe3O4纳米晶粒[9].当磁性纳米粒子的尺寸小于临界尺寸(对Fe3O4而言,一般为15nm)[4]时,会呈现超顺磁性.用物理性质测量系统(PPMS)检测所制备的纳米粒子,其磁滞回线图显示没有剩磁及矫顽力,说明纳米粒子呈超顺磁性.2.2　MNP APTES的表征　Fe3O4纳米粒子表面存在羟基[7],故可与硅烷偶联剂APTES反应.图1显示MNP APTES在2961cm-1处出现—CH3的C—H反对称伸缩吸收峰,1460cm-1处有C—H的反对称弯曲振动峰,2925和2856cm-1处的峰归属于—CH2—的C—H反对称伸缩振动和对称伸缩振动,说明表面甲基和亚甲基的存在.在1026cm-1处出现了Si—O—C的伸缩振动峰,在1094cm-1处出现了C—N的伸缩振动峰.表明获得了高反应性的氨基化超顺磁纳米微球.

2.3　MNP APTES Van的表征　Fe3O4纳米粒子表面的氨基与盐酸去甲万古霉素的羧基,在温和条件及EDC和NHS催化下可以发生反应,对比图2中的MNP APTES及MNP APTES Van的红外谱图可发现,在1261cm-1处出现酚羟基的面内弯曲振动峰,在1094cm-1处有伯醇的C—O伸缩振动峰,在1025cm-1处有苯环上C—H的面内弯曲振动峰,在868和804cm-1处有苯环的1,2,4取代吸收,说明粒子表面已被盐酸去甲万古霉素修饰.反应液中只有Van在280nm有紫外吸收,第一次洗涤MNP APTES Van的上层清液在280nm处已经没有紫外吸收,所以可以通过反应前后Van量的差值来估算与磁性纳米粒子反应的Van的数量.根据万古霉素在280nm处紫外吸收值与浓度的标准曲线,求得反应前后万古霉素的量差值为2 376×10-6mol,每克纳米粒子反应的盐酸去甲万古霉素量为2 808×10-5mol/g,纳米粒子平均直径以10nm计算,得每个纳米粒子表面的盐酸去甲万古霉素的量约为48个.2.4　细菌吸附分离　从OD值的结果(表1)可见,所制备的盐酸去甲万古霉素修饰的Fe3O4磁性纳米粒子可以很好地与金黄色葡萄球菌结合,并通过外加磁场将其从溶液中分离出来;但几乎不与大肠杆菌结合,因此当两者混合时,可以通过加入MNP APTES Van使其分开,因为万古霉素能与革兰氏阳性菌S.aureus细胞壁上的D Ala D Ala部分结合,而革兰氏阴性菌E.coliBL21的细胞壁结构大不相同,正是万古霉素的这种对细菌的选择性赋予MNP APTES Van对这两种细菌的高度选择性.图3表明MNP APTES Van几乎完全覆盖S.aureus表面,图4表明,E.coliBL21附近有很多MNP APTES Van聚集体,粒子未能与细菌表面结合.由于S.aureus被MNP APTES Van覆盖,在磁场作用下被分离出来,而E.coliBL21则不受外磁场影响.