高产DHA海洋真菌Thraustochytriumsp.N4-103脂肪酸组成及其18SrRNA基因的克隆与序列分
2007-05-04 21:21:56   来源：福建师范大学学报(自然科学版)   评论：0 点击：

二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,DHA)是一种极其重要的ω-3系列高度不饱和脂肪酸(ω-3-polyunsaturatedfattyacids),具有抗心血管疾病[1-2]、降血脂[3]、降血压[4]、预防癌症[5]、保护视力[6]、促进智力发育[7]和调控离子通道蛋白基因表达[8]等多种重要生理功能.DHA作为人体生长发育与机能维持所绝对必需的脂肪酸,已被开发成各种药品、功能性食品和化妆品等,呈现出巨大的市场.深海鱼油是DHA的传统资源,然而,由于鱼油DHA含量低、油品质不稳定、易受捕捞时间和地域等诸多因素的影响,不能满足日益增长的市场需求,探求新的DHA资源就显得十分迫切[9].研究小组已分离获得多株DHA高产海洋真菌[10-11].本文对菌株N4-103单细胞油的组成及其18SrRNA基因进行了克隆和测序分析.

1　材料与方法

1.1　脂肪酸甲酯标准品C14∶0甲酯,C16∶0甲酯,C18∶0甲酯,C18∶1甲酯,C18∶2甲酯,C18∶3(n-6)甲酯,C18∶3(n-3)甲酯,C20∶4甲酯,C20∶5(n-3)甲酯,C22∶5(n-6)甲酯,C22∶6(n-3)甲酯均购自SIGMA公司,其它试剂均为分析纯.

1.2　培养基(1)种子培养基(g/L):葡萄糖10,蛋白胨5,NaCl0.5.(2)发酵培养基(g/L):葡萄糖30,蛋白胨10,NaCl0.5.

1.3　松花粉垂钓法分离DHA高产菌株采集海水样品10mL,收集到无菌具塞的试管中,并加入已用紫外线消毒处理过的松花粉,28℃放置3d,使海洋真菌充分富集于松花粉周围.挑取富集了海洋真菌的花粉,于种子固体培养基上划线培养6d(28℃),获得单菌落.

1.4　脂肪酸甲酯的分析

1.4.1　菌丝样品甲酯化预处理参照文献[10-11]稍有改进.培养液离心(500r/min),得湿菌体,液氮处理后,研磨破碎鲜菌丝(含水量约为70%).取菌丝破碎样0.3g,加1mLCHCl3和1mLHCl/CH3OH(1mol/L)于带塞试管中,剧烈震荡2min,60℃酯化3h,充氮气挥发后,加1mLHexene和1mL蒸馏水,剧烈震荡1min,离心(1200r/min),取上层Hexene液相于另一管中,充氮气挥发后,再用100μLHexene溶解甲酯,并立即分析.内标品为C20∶0(200μg).

1.4.2　脂肪酸甲酯分析岛津气相色谱仪(GC-17A,Shimadsu,Kyoto,Japan),氢火焰检测器(FID),TC-70毛细管柱(GLScience,Tokyo,Japan),检测器和气化室均为240℃,氢气流速26.8mL/min,氮气(载气)流速4mL/min,分流比得上22∶1,空气流速354.2mL/min.柱温采用三阶程升:170℃(保持2min)10℃/min升温至190℃(2min),5℃/min升温至210℃(4min),10℃/min升温至220℃(8min).

1.5　单细胞油脂的提取离心得湿菌体,加入10倍体积的氯仿/甲醇,经匀浆破碎,脱水和减压浓缩.

1.6　脂质的分离纯化提取的总油脂上硅胶柱层析,先用氯仿洗脱得中性脂质,再用甲醇洗脱得极性脂质.中性脂质上薄层色谱(Kieselgel60,Merck,Darmstadt,Germany),先用V(苯)∶V(diethylether)∶V(已醇)∶V(氨水)=50∶40∶2∶0.5展层1/2距离,再用V(hexane)∶V(diethylether)=94∶6展层.10%硫酸喷雾后,于130℃(15min)显色.中性脂质各组份的定量分析采用薄层扫描密度仪(AE-6910,ATTO,Tokyo,Japan).极性脂质上荧光薄层色谱(Kieselgel60,Merck,Darmstadt,Germany),V(氯仿)∶V(丙酮)∶V(甲醇)∶V(醋酸)∶V(水)=50∶20∶10∶10∶5展层.磷脂经紫外观测定位后,收集于试管中,并用V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1抽提以备脂肪酸分析.

1.7　N4-103生物合成DHA的条件优化以4%葡萄糖、半乳糖、蔗糖、玉米淀粉为不同碳源,1%酵母膏、蛋白胨、豆饼粉、氯化铵为不同氮源,研究了菌株N4-103在不同培养温度(15、20、25、30℃)的生物量以及DHA产率变化.

1.8　18SrRNA基因的扩增为了分离得到完整的18SrRNA基因,采用了PCR技术,正向引物为18SP1(CCAACCTGGTTG-ATCCTGCCAGTA),反向引物为18SP12(CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT).PCR反应液组成(50μL):2μL4×dNTP混合液,0.5μM引物18SP1,0.5μM引物18SP12,5μL10×PCR缓冲液,1UnitTaq聚合酶(TakaraShuzo,Kyoto,Japan)和1μg模板DNA.PCR反应(GeneAmpPCRSystem9600,PECorporation,Norwalk,CT)按下列条件进行:95℃变性5min后,进行PCR循环,反应参数94℃变性30s,55℃退火1min,72℃延伸1min.30次循环后,在72℃延伸10min.4℃保存.

1.9　18SrRNA基因测序PCR产物经CONCERTTMRapidPCRPurificationSystem(GIBCOBRL)纯化后克隆至pGEM-TEasyVector(Promega,USA),并转化大肠杆菌菌株DH5α,蓝白斑筛选得阳性克隆,制备质粒DNA,并由毛细管电泳测序仪(ABIPRISM310GeneticAnalyzer;AppliedBiosystemsInc.)对其序列进行自动测定.1.10　基因序列分析将所测序列与已知Thraustochytrids菌株的18SrRNA基因序列(通过DNADataBankofJapanDDBJ;http:∥www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome.html)获得,按照SaitouandNei[12]的方法进行类聚分析(PHYLIP软件包).以Cafeteriaroenbergensis作为外群类,按Swofford(SwoffordDL.PAUPa*Phylogeneticanalysisusingparimony.Version4.SinauerAssociaes,Sunderland,Massachusetts,1998.)所述邻接分析法获得进化树.距离分析按Felsenstein[13]模型所述方法进行,最大相似值是在transition/transversionratio0.81获得.对各菌株的18SrRNA基因全序列进行遗传距离计算,计算次数设为1000次,并将计算结果进行一致化运算后作遗传进化图.

2　结果与讨论

2.1　脂肪酸的组型分析气相色谱分析表明(图1、表1)Thraustochytriumsp.N4-103菌体细胞油脂脂肪酸的组型为47.3%DHA,11.6%C22∶5(docosapentaenoicacid,简称DPA),9.4%C20∶5(eicosapentaenoicacid,简称EPA),9.1%C20∶4(arachidonicacid,简称AA)和22.6%C16∶0(软脂酸).

2..2　油脂的组成Thraustochytriumsp.N4-103细胞含有15.2%油脂.硅胶柱层析(表2)表明总油脂由42.6%极性油脂、45.3%中性油脂和12.1%糖脂组成.极性油脂中的DHA质量分数(57.6%)显著高于中性油脂中DHA的质量分数(35.4%).

2.3　DHA生物合成条件的优化从生物量以及DHA产率来看,最适碳源为葡萄糖,最适氮源为酵母膏;低温不利于N4-103细胞的生长而高温不利于DHA生物合成(表3).从产业化与商业角度考虑,保持25℃培养温度,不仅可以降低生物反应器致冷的能耗,同时又能保证DHA的产率最高.

2.4　18SrRNA基因序列测定将PCR扩增得到的基因片段(图2箭头所示),连接至pGEM-TEasyVector,并转化大肠杆菌菌株DH5α,蓝白筛选,得阳性克隆子,制备重组质粒,测定18SrRNA基因序列(图3)并登录Genbank(AB073309).该序列与Thraustochytriumsp.KK17-3呈现93.2%相似性,并具有破囊壶菌18SrRNA基因的特征插入序列(1428-1438bp)(图3,划线序列).

2.5　聚类分析将所测序列与已知Thraustochytrids菌株的18SrRNA基因序列,以Cafeteriaroenbergensis作为外群类,进行聚类分析,并建立进化树.Thraustochytriumkinnei,T.pachydermum,T.aggregatum,T.aureum,Schizochytriumlimacinum和S.aggregatum等已知的Thraustochytrids菌株在本文建立的系统发生树(图4)中的位置与Honda[14]等人的报道是高度一致.图4也表明了菌株Thraustochytriumsp.N4-103(箭头所示)是一株与Thraustochytriumsp.KK17-3亲缘关系最近的新种.

　　菌株Thraustochytriumsp.N4-103细胞油脂DHA含量(47.3%)比深海鱼油(7%～12%)高得多,它是替代鱼油作为DHA再生资源的理想选择.基于18SrRNA基因序列分析而建立起来的进化树表明该菌株是一株有开发应用价值的新菌株.