基因工程化抗ＣＤ3单克隆抗体及其诱导免疫耐受的研究进展
2007-05-02 23:55:26   来源：免疫学杂志   评论：0 点击：

　　自1986年美国ＦＤＡ批准鼠源抗ＣＤ3单抗ＯＫＴ3进入市场,ＣＤ3抗体的临床应用已经经历了二十年的历程。ＣＤ3单抗用于器官移植时的抗排异反应,取得了显著疗效,用于Ｔ细胞介导的自身免疫病的治疗也有良好的应用前景。但是由于ＣＤ3抗体的免疫原性和丝裂原性在临床应用过程中会产生严重的毒副作用,为解决这个问题,目前已有几种基因工程改造的靶向ＣＤ3分子的抗体在临床试验中。这些新型抗体在保持ＯＫＴ3抗体良好疗效的同时,大大降低了其毒副作用。尤其令人振奋的是,最新研究发现,抗ＣＤ3抗体具有独特的诱导免疫耐受的能力,即可产生针对特异性抗原的免疫无反应性而不会发生长期的整个免疫系统的抑制状态。用人源化的非丝裂原性ＣＤ3抗体开展的该方面研究已经进入临床阶段。本文仅就ＣＤ3抗体的工程化改造及其诱导免疫耐受的研究进展加以综述。

1　ＣＤ3抗体的基因工程改造

1.1　ＣＤ3抗体介导的毒性作用及其发生机理　ＣＤ3ＭｃＡｂ介导的毒副作用主要有两个方面:其一是由于抗体的免疫原性引起产生人抗小鼠抗体(ＨＡＭＡ),会阻碍ＣＤ3ＭｃＡｂ的再次使用,还有可能影响其它治疗或诊断抗体在这些患者中的应用。其二是由抗体丝裂原活性引起的细胞因子释放综合征,其临床表现是首次注射后伴发的严重的急性“流感样症状”[1,2],个别严重的会导致死亡。ＨＡＭＡ反应主要是由于抗体的鼠源性引起的。鼠源性抗体作为异源性蛋白在人体内可诱发人抗鼠抗体的产生(ＨＡＭＡ反应);同时鼠源性抗体的生物半衰期很短,这严重影响了鼠ｍＡｂ的治疗效果。多年来,ＣＤ3抗体引发细胞因子释放综合症的机理一直是研究的热点。研究结果提示,抗ＣＤ3抗体的丝裂原活性来源于抗体Ｆｃ段与Ｆｃ受体表达细胞的相互作用,引起一些促炎性细胞因子ＴＮＦ、ＩＬ 2、ＩＬ 3、ＩＬ 6、ＩＬ 10、ＧＭ ＣＳＦ和ＩＬ 4[3-5]的释放,其中ＴＮＦ、ＩＦＮ γ、ＩＬ 6三者联合作用是导致典型的”流感样症状”的主要原因[6,7],有研究表明ＣＤ3抗体治疗后,血清中如果只有ＴＮＦ,即使浓度很高,也不会导致流感样综合症[8],但ＴＮＦ对此反应的发生又是至关重要的,如果用抗ＴＮＦ抗体阻断ＴＮＦ作用,则可以完全防止流感样综合症的发生[9]。去除Ｆｃ段的抗体Ｆ(ａｂ′)2片段在体外则没有表现出丝裂原活性。丝裂原活性的大小与鼠抗体类型密切相关(ＩｇＧ2ａ>ＩｇＧ1>ＩｇＧ2ｂ>ＩｇＡ)[10,11],这与临床观察的结果一致,鼠源ＩｇＡ抗体不会产生大量的细胞因子,毒副作用很小[12]。进一步研究提示,抗体Ｆｃ段ＣＨ2ｄｏｍａｉｎ中的234、235以及237氨基酸是介导毒副作用的主要原因;同时,抗体Ｆｃ段ＣＨ2ｄｏｍａｉｎ糖基化水平对抗体的毒副作用也有重要的影响。

1.2　ＣＤ3抗体的基因工程改造　基于上述对ＣＤ3ＭｃＡｂ介导的免疫抑制作用以及毒副作用机理的研究,提示我们可以改变Ｆｃ受体结合区的特性或对其进行特殊设计产生新的抗体,同时可以通过制备嵌合抗体、改型抗体等抗体人源化等技术降低抗体的鼠源性。新型无Ｆｃ受体结合活性的抗体已经构建成功,这些新型抗体在保持ＯＫＴ3抗体良好疗效的同时,大大的降低了其毒副作用。目前已有几种基因工程改造的靶向ＣＤ3抗体在临床试验中。

ｈＯＫＴ3γ1(Ａｌａ Ａｌａ)是人源化ＩｇＧ1类的ＯＫＴ3抗体,234和235位的氨基酸残基突变为Ａｌａ,使其与Ｆｃ受体结合能力比亲本抗体降低了100倍。ｈＯＫＴ3γ1(Ａｌａ Ａｌａ)具有较低的补体激活能力和丝裂原活性。体外研究和动物实验均证实ｈＯＫＴ3γ1(Ａｌａ Ａｌａ)可以阻断Ｔ细胞功能以及Ｔｈ1向Ｔｈ2偏移。Ⅰ期临床研究表明,ｈＯＫＴ3γ1(Ａｌａ Ａｌａ)在治疗肾移植排斥反应中的疗效与常规ＯＫＴ3相似,但是毒副作用明显较轻。ｈＯＫＴ3γ1(Ａｌａ Ａｌａ)也适用于关节炎以及Ⅰ型糖尿病的临床治疗。在两类患者的临床观察中,未见明显的细胞因子释放,输注毒性较低,目前已经进入Ⅱ期临床试验[13]。

另一个无丝裂原活性的ＣＤ3ＭｃＡｂ是以人ＩｇＧ2的形式表达的人源化靶向ＣＤ3抗体ＨｕＭ291。人ＩｇＧ2不与Ⅰ型或Ⅲ型Ｆｃγ受体(ＣＤ64或ＣＤ16)反应。通过对ＨｕＭ291恒定区的两个位点(234和237位Ｖａｌ Ａｌａ)进行点突变,可以降低其与ＦｃγＲＩＩ的结合。这一突变可以大大减少抗体的丝裂原活性。在肾移植和异基因骨髓移植Ⅰ期临床研究中,给大多数患者使用该抗体后未检测到细胞因子释放,输注相关毒性减低,同时能介导免疫抑制作用。人ＩｇＧ抗体与细胞Ｆｃγ受体结合很大程度受糖基化水平的影响。因此在人ＩｇＧ1骨架上经ＣＤＲ移植以及通过单个关键氨基酸残基的突变(297位Ａｓｎ Ａｌａ)构建了一个低糖基化水平的人源化抗ＣＤ3

抗体ＣｈＡｇｌｙＣＤ3,(来源于鼠ＹＴＨ12.5)。临床实验表明,与预测结果一致,该突变可明显减少Ｆｃ受体结合及补体活化,同时在体外无丝裂原活性。Ⅰ期临床研究已经证实其在体内具有免疫抑制活性且毒性较低[14]。

2　ＣＤ3抗体诱导免疫耐受研究2.1　抗ＣＤ3抗体可以诱导免疫耐受　ＣＤ3抗体最初是作为免疫抑制剂用于临床治疗器官移植和自身免疫病的。但近来越来越多的证据表明ＣＤ3抗体可以诱导免疫耐受,即对特定抗原的免疫无反应状态。首先,Ｈａｌｌ等[15,16]报道用非丝裂原性的ＣＤ3单抗治疗组织不相容的心血管器官移植的大鼠,可诱导永久性的整体移植,存活时间超过200ｄ,而对照组动物在8ｄ之内即将移植物排除。这些受者,再次移植原供者皮肤时,可以在没有免疫抑制剂的情况下接受供体,而同种异体的第三者的皮肤则被排斥,表明这些大鼠对供者的同种异体抗原产生了耐受。受体鼠脾脏中编码ＩＬ 4和ＩＬ 5的ｍＲＮＡ的水平升高,这种Ｔｈ2细胞的偏离与体外研究的结果一致。体外研究显示,活化的Ｔ细胞与ＣＤ3单抗尤其是非ＦＣＲ结合型的ＣＤ3单抗共孵育时,可产生大量的Ｔｈ2型的细胞因子。

另一个可以提供证据的实验模型是ＮＯＤ鼠,这种小鼠可发生自发的自身免疫性胰岛素依赖型糖尿病,与人的糖尿病非常类似。研究表明[17-19],ＣＤ3抗体可以通过恢复对自身胰岛β细胞的耐受而使疾病得到逆转。给病鼠低剂量的ＣＤ3抗体,连续5ｄ,在不给予任何外源胰岛素的情况下均可使病鼠血糖恢复正常。这些小鼠在接受同基因胰岛移植时可以获得长期的存活,而异基因的皮肤移植物则很快被排斥[19],说明这种效应是稳定的,长期的而且是抗原特异的免疫耐受。Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ等[19]认为,由抗ＣＤ3抗体诱导的免疫耐受分为两个连续的阶段:第一阶段为诱导阶段,与给药时间相符,可使病鼠血糖迅速恢复正常,出现短暂的Ｔｈ2细胞的极化;第二阶段为维持阶段:以活跃的耐受状态为特点,有调节性Ｔ细胞产生,这些调节性Ｔ细胞可以阻断疾病通过病原性淋巴细胞向免疫缺陷的ＮＯＤ鼠过继转移。说明调节性Ｔ细胞对耐受的维持起着至关重要的作用[20,21]。

2.2　调节性Ｔ细胞的作用　在ＣＤ3抗体诱导的免疫耐受中,主要是调节性Ｔ细胞发挥着免疫调节作用。调节性Ｔ细胞在胸腺发育过程中经历了自身抗原的阳性选择,然后定居于外周以接触依赖的方式防止Ｔ细胞的活化。体外研究表明,调节性Ｔ细胞能抑制由ＣＤ3刺激引起的Ｔｈ细胞的增殖[22],抑制ＩＦＮ γ、ＩＬ 2的产生[23],还可以抑制移植物抗宿主反应(ＧＶＨＤ)[24]。ＣＤ4+ＣＤ25+Ｔ细胞及ＣＤ4+ＣＤ25-Ｔ细胞都可以表现出调节性Ｔ细胞的功能。调节性Ｔ细胞组成型表达ＣＴＬＡ4和ＣＤ28,共刺激分子ＣＤ28信号是调节性Ｔ细胞发育所必须的[25,26];而ＣＴＬＡ4的交联能诱导ＣＤ4+Ｔ细胞产生ＴＧＦ β1,ＣＴＬＡ4的抗体在体内也可以阻断调节性Ｔ细胞的抑制作用[27-29]。调节性Ｔ细胞可以产生ＴＧＦ β1,用中和性抗体中和ＴＧＦ β1则可以阻断调节性Ｔ细胞的抑制作用[28];提示,ＴＧＦ β1的产生对调节性Ｔ细胞的功能非常重要。一项基因剔除和过表达研究揭示了Ｆｏｘｐ3对调节性Ｔ细胞在外周发育及维持的重要性[30,31]。通过逆转录病毒将Ｆｏｘｐ3转染天然Ｔ细胞,可以使其变成调节性Ｔ细胞。过表达Ｆｏｘｐ3可以延迟Ｃｔｌａ4- -鼠自身免疫病的发生,提示两条信号通路之间存在一定的联系[30]。研究表明共刺激分子ＣＴＬＡ4和ＣＤ28的信号可以诱导表达Ｆｏｘｐ3,而后者对调节性Ｔ细胞的发育和功能是必须的。

2.3　ＴＧＦ β1在免疫耐受诱导中的重要作用　对于调节性Ｔ细胞所发挥的免疫抑制作用,ＴＧＦ β1是否是一个不可或缺的因素,曾经有过争议。目前认为ＣＤ4+ＣＤ25ｈｉ型细胞可以以不依赖ＴＧＦ β1的方式发挥调节性Ｔ细胞的作用,而ＣＤ4+ＣＤ25+调节性Ｔ细胞只有在产生ＴＧＦ β1时才能发挥其免疫调节功能。如下几组实验结果认为ＴＧＦ β1在调节性Ｔ细胞的功能中似乎并非必需。Ｋｅｍｐｅｒ等[32]用抗ＣＤ3和ＣＤ46抗体联合刺激人外周血淋巴细胞,发现调节性Ｔ细胞分泌了ＩＬ 10和ＴＧＦ β1,并证实是ＩＬ 10介导了免疫抑制作用,而ＴＧＦ β1在其中是否诱导了ＩＬ 10的产生则尚不清楚。Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｏ等[22]发现Ｔｇｆｂ1缺陷的调节性Ｔ细胞仍然具有免疫抑制作用,只是需要更高的细胞比例。这一结果说明体内存在着不依赖ＴＧＦ β1的调节性Ｔ细胞,但其并未阐明这种调节性Ｔ细胞是否是ＣＤ25ｈｉ类型的,因为ＣＤ25ｈｉ细胞可以通过封闭ＩＬ 2的作用以ＩＬ 2饥饿的方式来发挥抑制作用。Ｂｅｌｇｈｉｔｈ等[27]解释了上述实验结果,认为在ＮＯＤ鼠中是ＣＤ4+ＣＤ25ｈｉ型细胞发挥免疫抑制作用,而ＣＤ4+ＣＤ25+发挥免疫调节作用则必须有ＴＧＦ β1存在。近有研究发现,ＴＧＦ β1能诱导调节性Ｔ细胞产生ＩＬ 10,提示ＴＧＦ β1可能通过诱导产生ＩＬ 10来介导某些免疫抑制作用[33]。另有证据表明ＴＧＦ β1能诱导活化Ｔ细胞的凋亡和无能[34,35]。更多的实验结果说明ＴＧＦ β1在体内免疫耐受的诱导中是必须的。Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ等认为ＴＧＦ β1对调节性Ｔ细胞功能的发挥是非常关键的。在胰岛细胞中过表达ＴＧＦ β1,可以防止ＮＯＤ鼠的胰岛损伤和自身免疫性糖尿病的发生[36]。在体内,表达以ＴＧＦ Ⅱ型受体为主的Ｔ细胞可以自发活化,不被调节性Ｔ细胞抑制,也说明ＴＧＦ β1信号对于调节性Ｔ细胞抑制Ｔｈ细胞活化是必须的[37]。对Ｔｇｆｂ1- -鼠进行的研究也取得了与此一致的结果:这种小鼠很小就会死于自身免疫病,但如果去除其体内的Ｔ细胞,则可免于死亡[38]。这些结果均表明ＴＧＦ β1对调节性Ｔ细胞功能的发挥起着非常重要的作用。

2.4　ＴＧＦ β1防止自身免疫病的作用机理　关于ＴＧＦ β1的作用机理,目前的研究还不是很多。Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ等研究发现ＴＧＦ β1防止自身免疫病的发生是通过提高钙 钙调磷酸酶信号途径的活化阈值来实现的[39]。Ｔｇｆｂ1- -胸腺细胞胞内钙离子浓度升高,在非最佳刺激条件下,即表现出活化表型;与此相符的是Ｔｇｆｂ1- -胸腺细胞更能抵抗ＦＫ506对细胞活化的抑制作用;在用抗ＣＤ3和抗ＣＤ28的抗体联合刺激的ＣＤ4+Ｔ细胞中,加入ＴＧＦ β1可以防止钙离子内流、转录因子ＮＦＡＴ的活化及入核,抑制细胞因子产生和天然Ｔ细胞的增殖[40]。

以上研究结果表明,由调节性Ｔ细胞产生的ＴＧＦ β1提高了Ｔｃ和Ｔｈ细胞通过钙 钙调磷酸酶信号途径活化的阈值,从而使这些细胞在识别了自身抗原后,缺乏足够的活化信号而不能活化。

3　结语

ＣＤ3抗体被用于临床,是免疫抑制领域的一个重大突破,在抗移植排斥反应、ＧＶＨＤ和自身免疫病的治疗中都取得了显著的效果。特别是近年来大量研究证明,ＣＤ3抗体可以诱导长期的对疾病的免疫耐受状态,给ＣＤ3抗体的临床应用带来了更加令人振奋的前景。随着对ＣＤ3抗体诱导免疫耐受机制的不断深入的研究,必然会出现更好的治疗策略,比如:联合应用ＣＤ3抗体和ＴＧＦ β1配体;在体外用抗ＣＤ3和抗ＣＴＬＡ4抗体刺激自身的调节性Ｔ细胞回输病人体内将会抑制自身免疫病的发展,可以预见,ＣＤ3抗体诱导免疫耐受的特性一定会使其在自身免疫病、器官移植等领域得到越来越广泛的应用。