卫星搭载选育金霉素高产菌的研究
2007-04-08 08:11:36   来源：内蒙古大学学报(自然科学版)   评论：0 点击：

　　自1987年以来,我国已利用自行研制的返回式卫星及神舟号宇宙飞船进行了13次航天育种搭载试验,试验品种达1200多种.大量的试验表明,航天诱变育种具有变异频率高、变异幅度大、有益变异多、变异稳定、迅速等优点.目前普遍认为辐射和重粒子是诸多空间条件中引起微生物变异的主要因素〔1〕.2003年,内蒙古金河集团实业有限公司利用我国第十八颗返回式科学技术与试验卫星搭载金色链霉菌进入太空,利用外太空的复杂环境条件,对金色链霉菌进行诱变,筛选出了优质高产的生产菌株.

1　材料与方法

1.1　出发菌株金色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)JH-48,内蒙古金河集团实业有限公司保存.

1.2　试剂及仪器耐高温α-淀粉酶,上海生工;琼脂,SIGMA;金霉素标准品,中国兽药监察局;其余试剂均为AR级.恒温摇床TAKASAKISR7S,水浴锅TECHNE,pH计HANNA211,离心机Eppendorf5810,恒温培养箱Thermolyne42000,高效液相色谱仪SHIMADZULC-10AT;玻璃毛细管粘度计浙江宁波玻璃仪器制造厂;50L多参数发酵罐FMG-50L,上海国强生化工程装备有限公司.

1.3　试验条件采用微生物空间培养箱作为菌种搭载平台.空间飞行时间18d,飞行高度200～350km,轨道倾角63°,除瞬间环境有短时间的冲击振动外,微重力水平均在1.5×10-5g左右,电子辐射积分通量累计1×1010e/cm2·s,卫星内部LET辐射计量9.2×10-5Gy/d,轨道平均飞行周期90min,舱内温度5～34℃,离子辐射量:180～186毫仑.

1.4　培养基1)斜面培养基:麸皮60g,琼脂20g,(NH4)2HPO40.05g,葡萄糖1g,水1000mL,pH7.0.

2)平板分离培养基:麸皮20g,玉米粉2g,(NH4)2HPO40.1g,葡萄糖1g,KH2PO41g,琼脂20g,水1000mL,pH6.5.3)种子培养基:葡萄糖30g,豆饼粉20g,蛋白胨5g,酵母粉10g,CaCO32g,KH2PO40.2g,水1000mL,pH6.5.4)发酵培养基:淀粉60g,玉米粉30g,豆饼粉35g,蛋白胨10g,酵母粉4g,豆油20g,NaCl1g,NH4Cl1.6g,MgSO4·7H2O0.1g,CuSO40.5g,CaCO310g,耐高温α-淀粉酶0.3g,水1000mL,pH6.5.5)5L种子罐培养基:淀粉40g,豆制糊精28g,花生饼粉35g,蛋白胨10g,酵母粉9g,豆油4g,NaCl1g,MgSO4·7H2O0.25g,(NH4)2SO44g,KH2PO40.2g,CaCO33.5g,水1000mL.6)50L发酵罐培养基:淀粉50g,玉米粉30g,豆饼粉35g,蛋白胨10g,酵母粉4.5g,豆油15g,NaCl1g,NH4Cl1.6g,MgSO4·7H2O0.1g,CuSO40.5g,CaCO310g,耐高温α-淀粉酶0.3g,消泡剂0.02g,水1000mL.

1.5　实验方法

1.5.1　初筛　将空间搭载诱变处理过的孢子悬浮液稀释至一定浓度,涂布于平板分离培养基,30℃培养4～5d,挑取菌丝颜色鼠灰色、分泌可溶性色素、长势较好的菌落,在斜面上传代2～3次.

1.5.2　复筛　从成熟的斜面上刮取孢子,接种到装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中,32℃,200r/min,摇床振荡培养24h.以5%的接种量将种子培养液转接于装有60mL发酵培养基的500mL三角瓶中,32℃,220r/min,摇床振荡培养5d.

1.5.3　50L发酵罐放大实验　将复筛得到的高产菌株与出发菌株JH-48分别接种于斜面培养基,34℃,培养4～5d.从成熟的斜面上刮取孢子,接种到5L种子罐培养基中,32℃,150r/min,培养24h.以10%的接种量将种子培养液转接于50L发酵罐中,32℃,280r/min,培养120h.

1.5.4　菌体浓度的测定　采用离心法测定.先测离心管的重量W0,然后取10mL发酵液加入离心管,测定总质量W1,离心(2000r/min×3min),弃上清,测定沉淀物及管总质量W2.根据公式计算菌体浓度.菌体浓度=(W1-W0)(W2-W0)×100%

1.5.5　

金霉素效价的测定　

采用高效液相色谱法〔2〕.

1.5.6　总糖含量的测定　见文献〔3〕.

1.5.7　菌体粘度的测定　玻璃毛细管粘度计测定.2　结　果2.1　初筛与复筛出发菌株JH-48经卫星搭载处理后,初筛,得到35株新菌株,进一步复筛得到4株金霉素产量明显提高的搭载菌株:JH-01,JH-12,JH-23,JH-43.将4株搭载菌株连续传5代(表1).菌株JH-12产素能力平均为17180U/mL,与JH-48发酵单位(15205U/mL)相比提高了13.0%.

2.2　放大实验中新菌株与原始菌株生理生化特性的比较取搭载后产素能力较高的菌株JH-12与出发菌株JH-48分别在50L发酵罐中进行放大实验,对发酵过程中两菌株的物理、生物、化学等参数进行了比较.

2.2.1　生长特性的比较　在发酵过程中,JH-12的菌体浓度比JH-48高5～10%.发酵中后期,JH-48的粘度迅速降至2s,而JH-12仍可保持较高粘度,表明其菌体仍保持一定活力(见图1).发酵中期观察菌体形态(图2,图3),两者对比可见搭载菌株JH-12的菌丝较粗较长,菌丝交联度较高,菌丝内空泡较少.

2.2.2　发酵过程曲线的比较　在发酵中前期,溶解氧正常,搭载菌株与出发菌株的糖代谢速率基本一致,产物合成速率也基本一致;发酵后期,与出发菌株相比,搭载菌株活力较强,底物消耗速率略高于出发菌株,产物合成速率也明显高于出发菌株(见图4).发酵结束时,出发菌株的金霉素产量为18905U/mL,搭载菌株为21060U/mL,比出发菌株高11.4%.

　　通过以上实验验证,表明搭载菌株JH-12的稳定性和产素能力都明显优于出发菌株JH-48.目前该菌株已经应用于大规模生产.

3　讨　论　　金霉素产生菌金色链霉菌(S.aureofaciens)是杜加尔(Duggar)于1948年筛选得到的,其发酵单位只有165U/mL〔4〕.19世纪50年代后,我国实现了金霉素的工业生产.半个世纪以来,我国已经成为世界上最大的金霉素生产国,拥有3个规模较大的生产厂家.截至2000年,金霉素发酵单位产量为23000U/mL,但距离国外最高发酵单位30000U/mL还有很大差距〔5〕.经过多年传统方法的菌种选育和工艺优化,金霉素的发酵水平一直没有大的突破.本实验通过卫星搭载,选育出金霉素高产菌,其平均发酵单位达到28000U/mL,居全国第一,并接近国外发酵水平,目前该菌株已投入生产.空间诱变的方式有很多种,卫星搭载只是其中的一种,能否利用其他的空间诱变技术值得我们进一步去研究.

航天诱变育种是利用太空的物理环境作为诱变因子.太空环境条件复杂,与地球表面主要差异是微重力、宇宙射线、重粒子、变化磁场和高真空等,这些物理条件的综合作用使生物基因组DNA的碱基产生变异,并造成DNA的断裂和重组,产生基因突变.而且太空微重力和高真空环境干扰DNA损伤修复系统正常工作,阻止或者抑制DNA链断裂的修复.其中以高能重粒子的诱发突变作用最为明显,它能更有效的导致细胞内遗传物质DNA双链断裂,而且非重接性断裂所占的比例较高〔6〕.金色链霉菌通过卫星搭载实现DNA的断裂和重组,虽然其产素能力有所提高,但是DNA断裂和重组位点不明确,其真正的代谢调控机制还是一个空白.此外,是否能够通过基因工程的方法实现金色链霉菌DNA的重组都是我们值得进一步研究的课题.