利用原生质体融合技术选育高产菌株
2007-03-29 00:01:01   来源：河北师范大学学报/自然科学版/   评论：0 点击：

土霉素(ｔｅｒｒａｍｙｃｉｎ)是属于四环类的一种广谱抗生素,以其抗菌谱广、抑菌效果好、毒副作用小、饲料利用率高等优点,在医疗、畜牧业和农业上有广泛的用途和广阔的市场前景.近年来,随着菌种选育及工艺优化,发酵单位有了很大的提高,使一些厂家的平均发酵单位能够维持在34000Ｕ/ｍＬ左右[1].但由于诱变育种出现饱和现象,所选育的菌株到发酵罐后生长代谢慢或发酵单位低限制了常规育种的效果.原生质体融合技术使遗传物质的传递更为完整,可以获得性状优良的重组体.笔者研究室用常规育种方法选育出98#菌种,该菌种具有前期氨氮代谢快、实验罐通氨时间早、前期发酵单位高、后期发酵单位停滞的特点;保留菌种76#的特点是前期代谢慢但后期发酵单位高.利用原生质体融合技术将二者遗传物质重组,得到兼有二者特性的融合新菌种102#,其前期氨氮代谢比98#提高了10.0%、发酵单位比76#提高了13.0%.经传6代考察,102#菌种稳定性强.

1　材料和方法

1.1　材　料

1.1.1　菌　种龟裂链霉菌(Ｓｔｅｒｐｏｍｙｃｅｓｒｉｍｏｓｕｓ)76#和98#,笔者实验室保存菌株.

1.1.2　实验用培养基斜面培养基:麸皮,琼脂.母瓶培养基:淀粉30ｇ,黄豆饼粉3ｇ,ＣａＣＯ35ｇ,(ＮＨ4)2ＳＯ44ｇ,ＮａＣｌ5ｇ,玉米浆4ｇ,ＫＨ2ＰＯ40.15ｇ,水1Ｌ.发酵培养基:淀粉150ｇ,黄豆饼粉20ｇ,ＣａＣＯ314ｇ,(ＮＨ4)2ＳＯ414ｇ,ＮａＣｌ45ｇ,玉米浆4ｇ,ＫＨ2ＰＯ40.1ｇ,淀粉酶0.15ｇ,消沫剂0.1ｇ,水1Ｌ.菌丝体培养基及再生培养基:按照文献[2]配制.

1.2　方　法

1.2.1　原生质体制备及融合将龟裂链霉菌的孢子接入添加3,5,10ｇ/Ｌ甘氨酸的菌丝体培养基内,ｐＨ7.2～7.4,37℃培养17～18ｈ,收集菌丝,制备原生质体.原生质体具体过程及融合参照文献[3]并略加修改.

1.2.2　原生质体灭活将76#原生质体悬浮液5ｍＬ置于直径9ｃｍ的双碟中,震荡照射5ｍｉｎ,紫外灯为15Ｗ,垂直照射距离30ｃｍ[4].

1.2.3　原生质体再生原生质体经融合后,涂布于再生培养基,置37℃下培养到长出菌落.

1.2.4　融合子的筛选挑选与76#菌株菌落特征相同的菌落作为融合子.76#的菌落特征为菌落似车轮型,射线不明显;孢子色灰,前期代谢慢,7天发酵单位高.98#的菌落特征为菌落似车轮型,6～8条射线;孢子色白丰满,背面产褐色色素,前期代谢快,4天残氮低.根据4天残氮和7天发酵单位对融合子进行筛选.

1.2.5　分析方法总糖和还原糖测定:斐林试剂法.氨基氮测定:甲醛法.生物量测定:取发酵液称重,1500ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ,倾去上清液称重,计算湿菌体的百分比.发酵单位测定:参照文献[5]的方法.

2　结果与讨论2.1　Ｇｌｙ质量浓度对原生质体形成和再生的影响Ｇｌｙ在细胞生长过程中能取代细胞壁肽聚糖中的ＤＡｌａ残基,干扰交联,引起细胞壁结构的不完整,有利于去除细胞壁并释放原生质体.文献[6]表明,放线菌Ｇｌｙ以2～40ｇ/Ｌ为宜.笔者实验采用3个Ｇｌｙ质量浓度进行对比.结果表明,Ｇｌｙ为10ｇ/Ｌ时的原生质体形成量最大;Ｇｌｙ为5ｇ/Ｌ时的原生质体的再生率最大,因此实验采用5ｇ/ＬＧｌｙ(见图1).

2.2　灭活效果将紫外灭活的76#原生质体涂布在再生培养基上培养,37℃培养7ｄ,菌落数为0,灭活效果为100%.

2.3　原生质体融合效果以76#的菌落特征为标准,挑选融合子,共选出382株,经筛选得到8株融合菌株.98#4天残氮为100%,76#7天效价为100%,融合菌株的4天残氮和7天效价结果见表1.结果表明,融合子的氨氮代谢与亲本98#基本一致,7天发酵单位明显高于76#亲本.

2.4　传代稳定性对上述菌株进行稳定性考察,102#菌株的传代结果见表2.

由表2可以看出,随着传代次数的增多,发酵单位有一定的下降,对第6代菌株自然分离进行复壮,发酵单位达到原有水平.龟裂链霉菌的特点是随着传代次数的增加发酵单位有一定幅度的降低,并且通过自然分离可以恢复.在生产中常采用2代或3代菌种.融合子102#菌株保持了高产的稳定性,其他菌株的稳定性相对较差.

2.5　代谢特性考察

对102#菌株进行生理代谢考察,结果见图2.

结果表明,102#菌株在氨氮代谢、生物量和发酵单位等方面综合了2个亲本的优良性状,并在发酵单位上高于76#亲本13%.20Ｌ发酵罐中试结果达到39000Ｕ/ｍＬ,随着发酵工艺条件的优化,发酵单位有进一步提高的可能.

2.6　讨　论

　　1)以76#菌株的孢子颜色为筛选条件筛选得到328株菌株,以4天残氮水平、7天发酵单位为筛选条件初筛得到8株菌株.筛选得到的8株菌株4天残氮明显低于76#,略低于98#菌株;7天的发酵单位明显高于98#菌株,而且高于76#菌株,表现出氨氮代谢和发酵水平均优于双亲本的特点.因此,所选8株菌株为融合子,融合率为2.43%,其中102#菌株氨氮代谢和发酵单位明显优于两亲本.

　　2)102#菌株生理代谢特点为糖代谢、氨氮代谢明显快于双亲本,因此生物量明显高于双亲本.发酵前期102#菌株的发酵单位和双亲本没有太大的差异,是因为前期的快速生长抑制了抗生素的产生;在发酵中后期,102#菌株的发酵单位明显高于双亲本.

　　3)102#菌株经传代6次,菌落颜色仍然保持灰色,4天的残氮水平仍然明显低于双亲本,由此证明102#菌株的融合基因发生了重组并能稳定遗传.随着传代次数的增加,7天发酵单位有所降低,但通过自然选育,菌种可以恢复原有发酵水平.这是部分孢子发生突变退化的原因,经过纯化,仍能保持原有的优良性状.

　　4)与常规育种方法比较,原生质体融合使两亲本的遗传物质更加充分融合,得到的重组子遗传特性更稳定、突变幅度更大,在工业化生产中有较强的实用价值.