蛹虫草液体的深层发酵
2007-03-28 23:34:42   来源：中南大学学报(自然科学版)   评论：0 点击：

　　蛹虫草又名北虫草、北冬虫夏草,属于子囊菌亚门(Ａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ),麦角菌科(Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅａｅ),虫草属(Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ)的模式种,学名为Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ。蛹虫草在世界性分布天然资源数量很少[1]。蛹虫草含有30多种元素,主要活性物质包括虫草素及甘露醇等,其含量与冬虫夏草含量类似。大量研究结果表明:蛹虫草与冬虫夏草类似,具有多种功能,对人体具有明显的保护作用,可以作为冬虫夏草的替代品[2 9]。目前,蛹虫草生产仍以固体栽培为主,液体深层发酵研究的时间不长,许多培养条件如培养周期等的研究还不成熟[7],但是,液体发酵具有许多如培养周期短、活性物质易于提取的优点,很多药用真菌液体发酵的活性物含量远高于人工栽培的药用真菌的活性物含量,所提取的活性物含量约为人工栽培活性物含量的10倍多[10]。为此,本文作者研究蛹虫草的液体深层发酵条件。在单因素优化实验的基础上,进行小型分批式发酵罐实验,研究有利于蛹虫草生长及活性物质(甘露醇)生产的ｐＨ控制策略。

1　材料与方法

1.1　菌种蛹虫草(Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ)菌种由中南大学生物冶金教育部重点实验室提供。

1.2　培养基固体斜面ＰＤＡ培养基组成为200ｇ/Ｌ马铃薯(去皮)+20ｇ/Ｌ葡萄糖+15ｇ/Ｌ琼脂,ｐＨ值不控制。液体种子培养基组成为[11]:20ｇ/Ｌ蔗糖+20ｇ/Ｌ蛋白胨+0.5ｇ/ＬＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ,1ｇ/ＬＫＨ2ＰＯ4,ｐＨ值不控制。发酵培养基组成为:20ｇ/Ｌ蔗糖+10ｇ/Ｌ蛋白胨+0.5ｇ/ＬＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ+1ｇ/ＬＫＨ2ＰＯ4,ｐＨ值根据不同实验要求进行调节。

1.3　实验方法

1.3.1　培养条件及方法摇瓶培养基本条件:摇床转速为140ｒ/ｍｉｎ,温度为25℃,培养时间为5ｄ。发酵罐培养基本条件:在容积为10Ｌ的微生物发酵罐中装入6Ｌ液体培养基,液体接种量为5%(体积分数),摇床转速为150ｒ/ｍｉｎ,通气量为250～300Ｌ/ｈ,温度为25℃,培养时间为5ｄ。每隔8ｈ取样1次,每次取样100ｍＬ,测定菌丝体质量浓度和上层清液中甘露醇的质量浓度。

1.3.2　ｐＨ控制采用自动流加2ｍｏｌ/ＬＨＣｌ或4ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ控制ｐＨ值。

1.3.3　菌丝体质量浓度的测定取一定量的发酵液分装在离心管中,在转速为4000ｒ/ｍｉｎ条件下,离心20～25ｍｉｎ。倾去上层清液,用蒸馏水洗涤1次后,将沉淀置于70℃烘箱中烘至恒重再称量。

1.3.4　甘露醇浓度的测定这里考察的活性产物为甘露醇。分别取稀释至一定浓度的样品1ｍＬ及空白液1ｍＬ,置于不同的比色管中,用比色法[12]测定样品的吸光度,并计算样品中甘露醇的质量浓度。

2　结　果

2.1　摇瓶实验

2.1.1　最适宜温度的确定分别选择20,22,25,27和30℃5种不同的温度进行3组平行实验。在500ｍＬ摇瓶中装入培养基100ｍＬ,接种量为5%,摇床转速为140ｒ/ｍｉｎ,培养4ｄ,观察蛹虫草的生长情况。4ｄ后,测量菌丝体质量浓度,结果如图1所示。

徐桂香等[13 14]:蛹虫草在温度为15～30℃时都能生长,但温度明显影响蛹虫草的生长速度,且在28℃其生长速度最快。本实验结果表明:蛹虫草在20～30℃时都能生长,且在25℃左右时其生长情况最好,所得菌丝体质量浓度最高(19.15ｇ/Ｌ)。因此,选择25℃对蛹虫草进行培养。

2.1.2　初始ｐＨ值对蛹虫草生长的影响将培养基的初始ｐＨ值分别调至4.10,4.90,5.30,5.70,6.10,6.40和6.80,进行3组平行实验。培养4ｄ后测定菌丝体质量浓度,结果如图2所示。刘丽丽等[15]的研究结果表明:菌体生长速度随着初始ｐＨ值的升高而加快,在发酵起始ｐＨ值为中性时生长最好。但本实验结果表明,当液体培养基的初始ｐＨ值为6.10时,菌丝体质量浓度最高(10.63ｇ/Ｌ);当ｐＨ值为中性时,不利于菌丝体生长。

2.1.3　培养时间的确定在培养时间分别为1,2,3,4,5和6ｄ,培养温度为25℃,ｐＨ=6.10时进行3组平行实验,测定蛹虫草发酵液的菌丝体质量浓度,结果如图3所示。

可见,在前5ｄ的培养过程中,菌丝体质量浓度逐渐增加,尤其是第2～3ｄ菌丝体质量浓度呈直线上升。随后菌丝体质量浓度增长减慢,基本处于稳定期,生长第5ｄ即培养时间为120ｈ达到最大(17.13ｇ/Ｌ)。继续培养,产生菌丝体自溶现象,且菌丝体质量浓度开始下降,开始进入衰退期。

2.1.4　不同营养配方对蛹虫草生长的影响

通过不同碳源、氮源及无机离子配方,确定蛹虫草的最适宜发酵培养基。按表1配方配制9种培养基,250ｍＬ摇瓶装液量50ｍＬ,调节初始ｐＨ至6.10,25℃培养5ｄ,测定菌丝体质量浓度和上层清液中甘露醇的浓度。以菌丝体质量浓度和甘露醇质量浓度为分析指标进行极差分析和方差分析[15]。由分析结果可知,碳源、氮源及无机离子的最佳配方为:20ｇ/Ｌ蔗糖+5ｇ/Ｌ蛋白胨+1ｇ/ＬＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ。

2.2　小型发酵罐分批发酵实验

发酵液ｐＨ对微生物的生长和代谢具有重要影响。因此,在摇瓶发酵实验结果的基础上,考察蛹虫草在小型发酵罐中发酵的ｐＨ控制策略。

2.2.1　不控制ｐＨ发酵

在实验中不控制ｐＨ,每隔8ｈ取样1次,每次取样100ｍＬ,测定菌丝体质量浓度和上层清液中甘露醇的浓度,结果如图4所示。

由图4可得:

ａ.菌丝体生长曲线和甘露醇质量浓度曲线呈正相关关系,即随着菌丝体的生长,甘露醇质量浓度随之增加;由此可以初步判断,甘露醇为生长偶联型代谢产物。

ｂ.接种约80ｈ后,甘露醇质量浓度和菌丝体质量浓度均达到最大值,比陈晋安等[16]报道的菌丝体质量浓度达到最大值时间(144ｈ)大大缩短。ｃ.在不控制ｐＨ发酵条件下,发酵液的ｐＨ先下降而后上升;当ｐＨ约为5.5时,菌丝体质量浓度和甘露醇质量浓度均达到最大。ｐＨ值出现这种变化,可能是随着菌丝体的生长,分泌胞外活性物质如有机酸和甘露醇等,使得发酵液的ｐＨ值下降;当菌丝体质量浓度和甘露醇质量浓度达到最大后,由于培养基中养分耗尽,菌丝体开始自溶,开始利用有机酸及甘露醇等作为碳源,ｐＨ上升。

2.2.2　恒定ｐＨ发酵

由以上实验结果可知,初始ｐＨ为6.10时最适合菌丝体生长。运用自动流加酸碱的方法控制ｐＨ恒定在6.10,其他实验条件不变进行发酵实验。实验结果如图5和图6所示。可见,将初始ｐＨ控制为6.10在发酵初期有利于菌丝体生长,但一直恒定控制ｐＨ为6.10并不利于菌丝体的生长和甘露醇的生成。

2.2.3　分段控制ｐＨ发酵

上述实验结果表明:当菌丝体质量浓度和甘露醇质量浓度达到最大值时,ｐＨ维持在5.5左右。发酵初期将培养基ｐＨ控制在6.10左右有利于菌丝体生长。因此,设计2阶段控制ｐＨ策略,即开始控制ｐＨ恒定在6.10,接种后50ｈ左右再将ｐＨ恒定控制为5.5,其他实验条件不变。实验结果如图5和图6所示。可见,分段控制ｐＨ与不控制(自然)ｐＨ和恒定控制ｐＨ=6.10相比不仅菌丝体生长速率加快,且菌丝体最大质量浓度也明显增加。甘露醇产量的变化与菌丝体质量浓度变化一致。分段控制ｐＨ得到的菌丝体质量浓度与甘露醇质量浓度最大(菌丝体质量浓度为17.31ｇ/Ｌ,甘露醇质量浓度为43.47ｇ/Ｌ),与恒定ｐＨ=6.10发酵时相比,菌丝体质量浓度及甘露醇的质量浓度分别增加了87%和24%;与不控制ｐＨ发酵时相比,菌丝体质量浓度及甘露醇的质量浓度分别增加了32%和14%。因此,在3种ｐＨ控制策略中,分段控制ｐＨ液体深层发酵策略对蛹虫草生长最有利。

3　结　论

ａ.获得了蛹虫草摇瓶培养最优条件:接种量为5%(体积分数),摇床转速为150ｒ/ｍｉｎ,初始液体培养基ｐＨ为6.10,温度为25℃,培养时间为5ｄ。ｂ.菌丝体生长曲线和甘露醇质量浓度曲线呈正相关关系。以菌丝体质量浓度和甘露醇质量浓度为分析指标,确定了蛹虫草的最适宜发酵培养基组成为20ｇ/Ｌ蔗糖+5ｇ/Ｌ蛋白胨和1ｇ/ＬＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ。ｃ.采用ｐＨ分段控制发酵策略,不但菌丝体生长速度快,菌丝体质量浓度增加,同时甘露醇质量浓度也有明显增加,菌丝体质量浓度达到17.31ｇ/Ｌ,甘露醇质量浓度达到43.47ｇ/Ｌ。选择ｐＨ分段控制的液体深层发酵方式对蛹虫草发酵最有利。