重组人白细胞介素-18工程菌的培养及高密度发酵
2007-03-28 23:26:17   来源：齐鲁药事   评论：0 点击：

　　白细胞介素-18（ＩＬ-18）是ＩＬ-1家族成员，因能诱导Ｔｈ1类细胞产生γ-干扰素（ＩＦＮ-γ），又称ＩＦＮ-γ诱导因子（ＩＧＩＦ），是一种重要的免疫调节因子．大量研究证实，其在抗肿瘤、抗感染免疫中发挥重要的作用，具有潜在的临床应用前景［1～4］．有活性的成熟的人白细胞介素-18是由151个氨基酸组成的多肽，分子量约为19ｋｕ，不含疏水信号肽及糖基化位点，适合于在大肠杆菌中表达［5］．为保证进一步大规模的生产，本实验中对重组人白细胞介素-18工程菌的表达和生长规律进行研究，建立了一个适用于工业化的高密度、高表达的发酵工艺．

1　材料与方法

1 1菌种和质粒　宿主菌ＪＭ109由本室保存，重组质粒ｐＢＶ-220-ＩＬ-18由本单位构建和保存．

1 2培养基

1 2 1种子培养基：蛋白胨10ｇ，酵母粉10ｇ，ＮａＣｌ5ｇ，加水定容至1Ｌ．

1 2 2发酵培养基：酵母粉10ｇ Ｌ-1，蛋白胨10ｇ Ｌ-1，氯化铵1 5ｇ Ｌ-1，磷酸二氢钠5 5ｇ Ｌ-1，磷酸氢二钠9ｇ Ｌ-1，ｐＨ7 1．用前加入无菌的ＭｇＳＯ4 7Ｈ2Ｏ至1ｇ Ｌ-1，葡萄糖至5ｇ Ｌ-1．

1 2 3补料液成分：葡萄糖至500ｇ Ｌ-1，酵母粉100ｇ Ｌ-1，ＭｇＳＯ4 7Ｈ2Ｏ12ｇ Ｌ-1，以上成分分开灭菌，使用前再合并．

1 2 4试剂：蛋白胨和酵母粉均购自英国Ｏｘｉｏｄ公司，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺及考马斯亮蓝Ｒ-250购自Ｆｌｕｋａ公司，其余为国产分析纯试剂．1 2 5仪器：ＮＢＳ发酵罐，美国ＮＢＳ公司；电泳图像分析系统购自ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃｈ公司．

1 3方法

1 3 1种子的活化：取在-70℃保存的工程菌株划板，37℃培养约16ｈ，挑单克隆接种于含3ｍｌＬＢ培养基（含氨苄青霉素100μｇ ｍｌ-1）的试管中，37℃，200ｒｐｍ ｍｉｎ-1培养10ｈ左右．即为活化种子．

1 3 2工程菌三角摇瓶培养：取活化的种子，以1%接种量接种于含200ｍｌＬＢ培养基的500ｍｌ摇瓶中，37℃，250ｒｐｍ ｍｉｎ-1振荡培养，当ＯＤ600为2～2 5时可以作为10Ｌ发酵的种子液．

1 3 310Ｌ高密度发酵培养发酵罐中的起始工作体积为5Ｌ，在罐中接入三角瓶培养的三级种子液（接种量为10%），装料前校正ｐＨ和溶氧电极，发酵温度30℃，起始转速250ｒ ｍｉｎ-1．发酵过程的关键参数为（1）溶氧量及转速：溶氧控制在30%～60%，达到最大转速800ｒ ｍｉｎ-1后，自动通入纯氧；（2）温度：控制为30℃；（3）ｐＨ：设定为7 0，自动流加30%氨水以保持恒定；（4）补料的流加：发酵过程中0～6ｈ不加补料，6～18ｈ补料流速设定为50ｍｌ ｈ-1，18～24ｈ补料流速设定为100ｍｌ ｈ-1．

1 3 4分析方法：

菌体光浓度值用比色法测定，以Ａ600ｎｍ值表示；用分析天平称量菌体湿重；发酵液菌体做聚丙烯凝胶电泳（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ），电泳图像分析系统扫描测定重组人白细胞介素-18的表达量；用ｐＨ计测定发酵液菌体的ｐＨ值．2　结果2 1ｐＨ对工程菌的生长和目的蛋白表达的影响　ｐＨ分别为6 5、7 0和7 5，其他的参数保持一致，结果表明（表1）：ｐＨ值控制在7 5时，目的蛋白的表达量和收菌量都最低；ｐＨ值是6 5时，表达量与7 0时相当，但是收菌最低，ｐＨ值是7 0时表达量和收菌量均较高．

2 2溶氧浓度对工程菌生长和目的蛋白表达的影响　溶氧浓度是通过改变搅拌速度和通气中的纯氧含量对其调整和补偿，将溶解氧分别设定在40%～60%，30%～60%，20%～60%，结果见表2，20%～60%时，收菌量最低，而表达量在3个不同范围内相当．因此，应当将溶解氧维持在30%以上，从而保证工程菌的产量．

2 3诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响

　工程菌培养6ｈ左右，升温至42℃对工程菌进行温度诱导，每隔1ｈ取样，测菌体密度Ａ600，同时进行ＳＤＳ-ＰＡＧＥ电泳，结果见图1，结果表明：诱导4ｈ的收菌量和目的蛋白表达量均较高．

3　讨论

高密度培养技术，也就是高密度发酵技术，提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率（单位体积单位时间内产物的产量）不仅可以减少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期，减少设备投资从而降低生产成本，能极大的提高产品在市场上的竞争力．重组大肠杆菌高密度培养，除了重组菌本身的表达性质外，还包括适宜的培养基组成、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响［6，7］．本研究中，当Ａ600为5 0～6 0时开始诱导，菌体得率和目的蛋白表达量都比较高，分析其原因可能是工程菌处于对数生长期，菌体生长速度比较快，此时进入诱导状态，目的蛋白的积累加快，表达水平才能达到最高．如果在对数生长后期才开始诱导，由于发酵液中营养的消耗、氧气的缺乏及代谢产物的积累，影响了外源基因的高效表达．在实验中还观察了溶氧浓度对菌体得率和白细胞介素-18表达的影响．工程菌在大量扩增工程中耗氧进行分解代谢，如果供氧不足就会抑制细菌的新陈代谢．因此，溶解氧的浓度至少要大于30%．我们对单个因素逐个优化，最终达到对整个工艺的优化，我们采用建立的中试发酵工艺，连续发酵三批10Ｌ罐发酵工程菌，其结果的稳定性和重复性较好．