蓝色犁头霉JY 2#的选育与发酵特性
2007-03-28 23:08:26   来源：天津科技大学学报   评论：0 点击：

　　氢化可的松(Hydrocortisone,HC)是一种肾上腺皮质激素类药物,在临床上应用广泛。同时它还是生产泼尼松等其他类高效皮质激素药物的基础原料。HC的生产是以化合物RS(17α 羟基孕甾 4 烯 3,20 二酮)或化合物RSA(17α 羟基孕甾 4 烯 3,20 二酮 21 醋酸酯)为底物经过微生物的11β 羟基化反应得到。微生物菌种对HC的转化率和收率影响很大[1],选育具有高转化能力的优良菌种一直是甾体生物转化研究领域的重要目标之一。　　HC的微生物转化菌种主要有两种,国外主要采用新月弯孢霉(Curvalarialunata),它对底物RS的转化率达90%左右,收率为60%[2—4];国内普遍采用蓝色犁头霉(Absidiacoerulea),它以化合物RSA为底物,转化率一般为70%左右,收率45%[5]。由于蓝色犁头霉的生产能力较低,目前国内在育种领域的研究主要集中在两个方面,一是选育新月弯孢霉,企图逐渐替代现有生产菌蓝色犁头霉[6,7],二是对蓝色犁头霉进行遗传改造,不断提高其转化能力。本文主要利用原生质体紫外线诱变结合底物抗性筛选的方法,选育蓝色犁头霉高转化菌株,并对筛选得到的抗性突变株JY 2#的转化条件进行了初步研究。

1.1　菌种　　蓝色犁头霉(Absidiacoeralea)JY 11,天津科技大学应用微生物研究室保存。

1.2　培养基　　斜面培养基:PDA培养基。　　土豆汁培养基(g/L):土豆汁1000mL,葡萄糖20,KH2PO42,pH自然。　　种子培养基和菌丝液体培养基(g/L):葡萄糖10.5,酵母膏2.3,玉米浆12.5,硫酸铵5.0,pH6.4～6.7。　　发酵培养基(g/L):葡萄糖10.5,酵母膏2.5,玉米浆12.0,硫酸铵5.0,pH6.4～6.7。　　高渗再生培养基:以0.4mol/LNH4Cl配制的土豆培养基。

1.3　原生质体的制备与再生　　按文献[8]的方法进行制备。将制备好的原生质体于含有0.4mol/L的NH4Cl的高渗磷酸缓冲液(pH6.0)中稀释至1.0×106个/mL。

1.4　底物RSA抗性突变株的分离　　吸取浓度为1.0×106个/mL的原生质体悬浮液3mL于?75mm的无菌培养皿内,于15W的紫外灯下,距离30cm照射7.5s。取1mL诱变处理液适当稀释后,吸取0.1mL于含有一定量底物的抗性平板上,28℃避光培养5d,生长出的菌落即为抗性突变株。

1.5　甾体转化实验

1.5.1　摇瓶转化实验　　无菌水洗下斜面种子,制备成1×107个/mL的孢子悬浮液,取0.3mL接种于盛有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中,28℃,150r/min振荡培养19～21h,至培养液的pH降至3.8左右时,投入1.2mL的底物RSA乙醇溶液,(底物RSA在发酵液内的终浓度为2.5g/L)。调节pH至5.4,继续培养24h,取样测定氢化可的松的转化率。

1.5.2　5L发酵罐转化实验　　将孢子悬浮液以1%接种量接种于盛有30mL种子培养基的250mL三角瓶中。28℃,150r/min振荡培养17～19h。以10%接种量将种子转接于5L发酵罐内(装液量3L),在28℃、转速280～300r/min、通风量1∶0.5(V/V)条件下,培养13～15h,至培养液的pH降至3.8左右时,投入120mL含底物RSA的乙醇溶液(底物RSA的终浓度为2.5g/L)。调节pH至5.4～5.8。继续培养24h,取样测定氢化可的松的转化率。

1.6　底物RSA转化程度的分析　　采用氧化级别比色分析法。取发酵液10mL于分液漏斗中,加入等量的混合溶媒,振荡,静置分层,取下层有机相。然后加入10mL蒸馏水洗涤两次,得萃取液。定量取5mL于比色管中,加5mL浓硫酸,混合均匀后于沸水浴加热,显色。与标准比色管目视比色,确定氧化级别,以此来表示底物的转化程度。氧化级别分为0,1,2,3,4,5共六级,级别越低,表明转化程度越高,底物转化得越完全。

1.7　产物氢化可的松转化率的测定　　采用高效液相色谱法测定[9]。

2　结果与讨论

2.1　底物RSA抗性突变株的筛选　　将经过紫外线诱变处理的蓝色犁头霉原生质体细胞经适当稀释后,倾注于含有一定量化合物RSA的再生培养基平板上。待长出再生菌落后,挑选到60株突变菌株,进行摇瓶发酵实验检测HC转化率,其中有8株突变菌株的HC转化率高于出发菌株,结果如表1所示。利用底物抗性突变筛选法获得高转化菌株的几率较高,大约14%的抗性菌株是HC转化率获得提高的菌株。其中突变株JY 2#的HC转化率为81.63%,较出发菌株提高了14.1%。

2.2　突变株的生长特性　　突变株JY 2#在发酵培养基中的生长曲线如图1所示。0～6h为突变菌株JY 2#生长的延迟期,快速生长期始于6h,至19h达到稳定期。在菌体生长过程中,菌体的生长时期与培养基的pH有很强的相关性。菌体的快速生长期也是培养基pH的快速下降时期,当菌体生长到达稳定期时,pH降至最低点3.7。随着菌体的进一步生长,培养基的pH在3.7左右维持3～4h,然后开始回升。与出发菌株JY 11相比,选育的突变菌株JY 2#生长延迟期有所缩短,到达稳定期的时间提前了近2h,即它的生长繁殖能力较强。

2.3　突变株JY 2#的5L发酵罐转化实验

2.3.1　种龄的选择　　突变菌株JY 2#的种子生长曲线如图2所示。在0～8h以内,培养液外观状态几乎无变化,菌体生长处于延迟期,8h时进入快速生长期,20h左右达到稳定期。此时培养的菌体呈芝麻粒状。分别取16～24h不同种龄的种子转接于发酵罐内,进行菌体培养,投料,发酵,结果如表2和图3所示。

　　结果说明种龄在16～22h之间的种子转接于发酵培养基内培养的菌体均能在24h以内将底物RSA转化完全,种龄为17～19h的种子,得到的HC转化率最高。种龄大于21h的种子在发酵培养基内的生长较为缓慢,发酵液的pH降至3.8的时间有所延长,比17～19h的种子延长了2～4h,HC的转化率开始下降。

2.3.2　接种量的影响　　

接种量对HC转化结果的影响见表3。　　结果说明,接种量为10%的HC转化结果较好,在24h内不仅能将底物转化完全,所得到的氢化可的松的转化率也较高。

2.3.3　转化动力学曲线　　通过以上实验,确定5L发酵罐转化工艺参数分别为:培养基装液体积3.5L,种子种龄17～18h,接种量10%,通风量1.75L/min,搅拌转速280～300r/min,发酵温度28℃。连续发酵三批次,HC平均转化率达82.46%。图4是底物RSA在5L发酵罐内的转化反应过程曲线。(

3　结　语　　利用原生质体紫外线诱变结合底物抗性筛选的方法,以蓝色犁头霉JY 11为出发菌株,选育出氢化可的松高产菌株JY 2#,其氢化可的松转化率达81.63%,较出发菌株提高了14.1%。分析了该菌株的生长特性,与出发菌株JY 11相比,选育的突变菌株JY 2#生长延迟期有所缩短,到达稳定期的时间提前了近2h,其生长繁殖能力较强;对突变株JY 2#在5L发酵罐的转化工艺进行了研究,实验表明,种龄、接种量对转化结果有很大影响,最佳种龄为17～19h,最佳接种量为10%;在此基础上,确定5L发酵罐转化工艺参数,HC平均转化率达82.46%。