红霉素高产变株F1-57的选育及发酵工艺研究
2007-03-24 20:55:27   来源：福建师范大学学报(自然科学版)   评论：0 点击：

1　材料与方法

1.1　菌种红色链霉菌(Streptomyceserythreus)2-9#;短小芽孢杆菌CMCC(B)63202.

1.2　培养基

1.2.1　斜面培养基(%):淀粉、玉米浆、蛋白胨、(NH4)2SO4、NaCl、CaCO3、琼脂按比例配制,pH7.0.1.2.2　种子培养基(%):淀粉、糊精、葡萄糖、(NH4)2SO4、蛋白胨、酵母粉、黄豆饼粉、NaCl、MgSO4、KH2PO4、CaCO3按比例配制,pH自然.

1.2.3　发酵培养基 (%):淀粉、糊精、葡萄糖、黄豆饼粉、(NH4)2SO4、NaCl、MgSO4、KH2PO4、CaCO3按比例配制,pH自然.

1.2.4　发酵培养基 :由发酵培养基I改良得.

1.3　培养条件

1.3.1　斜面:母斜面37℃培养7～9d,子斜面37℃培养6～7d.

1.3.2　种子摇瓶:28℃培养48～52h,摇瓶转速240r/min.发酵摇瓶:28℃培养166～180h,摇瓶转速240r/min,接种量10%.1.3.3　发酵过程加入总量1.0%的正丙醇.1.4　效价测定采用一剂量管碟法测定生物效价[4],检定菌为短小芽孢杆菌CMCC(B)63202,标准品采用中国药品生物制品检定所制备的标准品,批号3078811,效价888u/mg.1.5　紫外线诱变处理以红色链霉菌(Streptomyceserythreus)2-9#作为出发菌株,用20mL生理盐水刮洗下培养好的新鲜斜面孢子,用玻璃珠打散,过滤,制得孢子悬浮液(3.29×106个孢子/mL),取6mL该孢子悬浮液于直径为9cm的培养皿中,置于磁力搅拌器上,在15W紫外灯管(λ=253.7nm)下(距离28.2cm)分别照射15、25、35s,稀释10-1～10-5,分别涂布于含有1.5%丙酸钠(下层)和0.2%氯化锂(上层)的梯度平板上,恒温培养.

2　结果与讨论

2.1　紫外诱变与突变株分离自20世纪80年代出现链霉菌基因克隆技术以来,聚酮体类抗生素生物合成的分子遗传学研究不断深入[5],聚酮体是通过连续的低级羧酸如乙酸、丙酸等在聚酮体合成酶(PKS)作用下脱羧缩合而成.由于红霉素内酯环的骨架是由7个丙酸单元聚合而成的,前体丙酸需经过丙酸激酶的催化作用参入红霉素的生物合成,而前体替代物丙醇可用作产生乙酰CoA羧化酶的诱导物,并通过甲酰基丙二酰辅酶A参入红霉素内酯环的合成,可通过筛选丙醇抗性突变株来提高红霉素的生产能力[6],而UV诱变过的存活孢子经氯化锂修饰,有“提高突变‘易出误差’修复”的作用[7].因此,作者通过UV对红霉素产生菌2-9#进行诱变,并通过采用含有丙酸钠、氯化锂的梯度平板,进行定向筛选耐丙酸钠的突变株.经UV处理15、25、35s,并经含丙酸钠、氯化锂平板培养的平板中各挑选出100个菌株进行摇瓶试验,结果见表1.

　　从表1的结果可知,UV与氯化锂复合处理红霉素产生菌2-9#其效果明显,其最高正变率达到47%.效价提高5%的菌株较多,作者从中选出了5株(其编号分别为F1-16、F1-25、F1-53、F1-57、F1-99)进行摇瓶复筛,结果见表2.

        从表2的摇瓶复筛的结果可以看出,有4株菌其复筛结果效价较出发菌株提高了10%以上.作者选用F1-57高产变株进行下面的实验.2.2　高产变株的培养基优化由于红霉素高产变株F1-57是原菌株经诱变后筛选得到的,其遗传物质已经发生了改变.因此,发酵培养基的配方也应进行相应的调整,根据经验及有关文献报道,作者选择了发酵培养基中的黄豆饼粉、硫酸铵、磷酸二氢钾、葡萄糖4个因素,对红霉素高产变株F1-57,利用正交表L9(34)进行发酵培养基配方的正交试验.结果见表3、4.

    从正交试验的结果可知,在试验的4个因素中,黄豆饼粉对发酵效价的影响最大,其次为硫酸铵、葡萄糖、磷酸二氢钾.从分组试验的情况可以看出,第8组发酵效价最高,较对照组高出了12.4%.因此,在F1-57菌株的发酵过程中,氮源是影响发酵水平的重要因素,其次是碳源.在发酵过程中适当增加黄豆饼粉和葡萄糖的含量,对发酵水平的提高是有利的.第8组经优化后的发酵培养基组合定为发酵培养基 .

2.3　前体物的耐受性试验作者在发酵过程中加入不同量的正丙醇,加入的方法不变(基础料中加入1/3,余下2/3分5次加入),考查亲株2-9#与变株F1-57在不同正丙醇加量的条件下的发酵情况.结果见表5.

从表5可以看出,正丙醇作为内酯环生物合成的前体可使红霉素增产,F1-57菌株最高增产幅度为110.2%.但过量的前体物对产生菌的生长和抗生素的合成有抑制作用.由表5还可看出,由于F1-57是通过耐前体物的筛选而得到的,因而,随着菌体对前体物的耐受性的增加,菌体利用前体产抗的能力也得到了加强.试验中还发现,前体物一旦过量,发酵液中菌体很容易提前自溶,pH值快速增高,延长发酵周期,效价不升反降.因此,如何控制好红霉素产生菌所耐受前体物浓度的临界点,在发酵过程中是十分重要的,既要提供充足的前体物供内酯环的生物合成,又要防止前体浓度过高引发菌体毒性,使菌丝体过早自溶,从而影响产抗水平.试验结果表明使用F1-57变株进行发酵,正丙醇总使用量控制在1.2%为宜.试验证明,通过诱变的方法,筛选对前体物耐受性强的菌种以提高发酵产量是可行的.由于抗生素合成的复杂性,在抗生素合成过程中有多种受基因调控的相关酶系被诱导或被阻遏,如何通过阻遏的解除来获得高产优质的抗生素有待进一步的研究.