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紫杉醇树状多节孢原生质体的制备和再生
2006-09-17 16:37:28 来源：不详评论：0 点击：

紫杉醇是近年来发现的最重要的抗癌药物之一，能够有效地治疗多种癌症．最早是由美国的Wani等分离自短叶红豆杉(Taxus brevOColia) ．但红豆杉树中紫杉醇含量极低，而且世界上红豆杉资源非常匮乏，解决紫杉醇的药源一直是个难题．1993年，S~bel等从短叶红豆杉的树皮中分离到一种内生真菌Taxomycesandreanae ，Stierle等证明这种内生真菌可以产生紫杉醇．这项工作，使微生物发酵法成为继组织培养、细胞培养、化学合成等方法之后的解决紫杉醇来源的新途径树状多节孢是从东北红豆杉(Taxus cusp／data)中分离到的可产生紫杉醇的内生菌，而且是我国的新记录属 J，但其紫杉醇产量不高(51．06～125．70 o-g／L)．欲通过原生质体技术开展树状多节孢的遗传育种工作，必须探索原生质体制备、再生的适宜条件．由于真菌细胞壁的成分复杂，菌种间的差异也比较大，再加上原生质体的制备和再生过程中要受到多种因素的影响，所以尽管关于丝状真菌原生质体研究的报道

很多，但是不可能得到一种适用于各种原生质体制备、再生的方法．我们对树状多节孢的原生质体制备和再生条件进行了较为详细的研究，研究结果基本探索出了树状多节孢原生质体制备和再生的条件，为以后通过原生质体诱变转化融合构建紫杉醇工程菌株奠定了基础．

1 材料和方法

1．1 菌株

树状多节孢HQD33(Nodulisporium sylvlfo,~ )，分离自东北红豆杉．

1．2 酶

纤维素酶(Cellulase)，购自上海丽珠东风生物技术有限公司；蜗牛酶(Snailase)，购自北京百泰生化技术公司；溶菌酶(Lysozyme)购自上海伯奥生物科技公司．

1．3 培养基

1．3．1 PDA培养基、查氏培养基、麦芽汁培养基、酶母膏培养基．

1．3．2 CM培养基(o／s L ) Msso ·7H：00．5；KH2PO 0．46；K2HPO41；蛋白胨2；酵母膏2；葡萄

糖20；琼脂20；加水至1 L．

1．3．3 再生固体培养基培养基中加人相应的渗透压稳定剂．

1．3．4 再生半固体培养基将再生固体培养基中的琼脂浓度降至7 g／L即可．

1．4 渗透压稳定剂0．7 mol／L NaCI，0．7 mol／L KCI，0．7 mol／L甘露醇，0．7 mol／L葡萄糖，0．7 mol／L蔗糖．1．5 酶液的配制称取所需酶，用0．7 mol／L的渗透压稳定剂溶解后，4 000 r／min低温离心15 min，取上清液过滤除菌后使用．

1．6 原生质体的制备

将培养好的菌悬液3 000 r／min离心10 min收集菌体，用旋涡混合器将菌体打散均匀，用渗透压稳定剂洗涤两次．然后每300 mg湿菌体加人1 mL酶液，在适宜的温度下酶解，反应期间每隔一段时间吸取少量酶解液镜检观察菌丝变化和原生质体制备情况，用血球计数板计算原生质体数．1．7 原生质体的纯化将酶解液用无菌3层镜头纸(杭州市余杭太平工艺照相器材厂产品)过滤，滤液3 000 r／rain离心10

min，除去上清液，用渗透压稳定剂洗涤2次，然后在渗透压稳定剂中悬浮，得到纯化的原生质体悬液．

1．8 原生质体的再生

用液体再生培养基将原生质体悬液进行系列稀释，分别采用下列方式培养．单层平板培养法：将原生质体的系列稀释液直接涂布于再生培养基的固体平板上，23~25~C培养3～5 d．双层平板培养法：吸取0．5 mL原生质体系列稀释液于4．5 mL高渗半固体培养基中混匀，然后倾注于相应的固体高渗再生平板上，23～25℃培养3～5 d．另外，取纯化后的原生质体悬浮于未加渗透压稳定剂的液体再生培养基中处理30 min，然后在未加渗透压稳定剂的固体培养基中涂布培养，作为对照．用公式R=(N。一 )／L~ 计算原生质体再生频率．(R：原生质体再生频率；：高渗再生培养基上长出的菌落数；：对照培养基上长出的菌落数；Np ：原生质体数)

2 结果和讨论

2．1 原生质体的制备

2．1．1 sylv~orme 菌丝d 2．58～6．45／．tm，细胞内容物在菌丝中均匀分布(见图1A)．酶解l h左右，菌丝形态开始发生变化，原生质体开始形成，随着时间的延长。菌丝断裂，菌丝内容物成串状(见图1B)，原生质体大量产生．在原生质体形成过程中，可以看到大多数原生质体是以顶端释放(见图1C)和原位释放(见图1D)两种方式形成．显微镜下原生质体大小不均，大部分原生质体的d在3．4／．tm～10．3／．tm之间(见图1E)．

2．1．2 酶系统的选择在原生质体释放过程中，由于不同真菌细胞壁结构存在差异，需要不同的酶系统” ．我们比较了纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶3种单酶及三者的混合酶液对树状多节孢原生质体制备的影响(表1)，发现纤维素酶和蜗牛酶都可以制备到原生质体。而且纤维素酶的效果明显好于蜗牛酶．另外，李武军、郑幼霞等认为，虽然溶菌酶对霉菌原生质体制备完全无效，但是在有纤维素酶存在时，加人溶菌酶对提高原生质体形成有着非常重要的作用．所以我们在设计酶系统时，采用2％蜗牛酶和1％溶菌酶与不同浓度的纤维素酶组成复合酶系，主要研究了不同浓度的纤维素酶对原生质体制备率的影响，结果表明，以3％纤维素酶+2％蜗牛酶+1％溶菌酶为酶系统，可以获得最大量的原生质体．制备真菌的原生质体时浓度适宜的复合酶较单一酶类更好，这个结论与前人的研究结果一致 “。】．未完待续。

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