发酵茯苓菌丝体和天然茯苓多糖的研究
2007-04-13 14:58:30   来源：天然产物研究与开发   评论：0 点击：

　　茯苓来源于多孔菌科真菌茯苓[Ｐｏｒｉａｃｏｃｏｓ(Ｓｃｈｗ.)ｗｏｌｆ]的菌核,具有利尿、镇静、抗肿瘤、增强免疫等方面的药效,属药食两用的大宗药材,目前茯苓全国年需用量达17000左右。用液体发酵培养及分离提取等新技术来生产茯苓,可连续地、大规模地进行工业化生产,大大缩短生产时间,并可节省大量的木材,对我国资源和生物多样性的保护有着重要的意义。茯苓的液体发酵正逐渐成为研究的热点[1,2]。发酵茯苓菌丝体与野生或人工种植的天然茯苓(干燥菌核)所含活性成分有所差别,因此,应将茯苓发酵菌丝体视为一种新型的发酵中药[3 5]。多糖是茯苓的主要活性成分,本文以发酵茯苓菌丝体和天然茯苓为材料,探讨了茯苓多糖的提取分离工艺,并分别对二者总多糖的提取率及总糖的平均含量进行了测定,为茯苓相关保健食品和药品的开发打下基础。

1　材料和主要仪器

1.1　材料发酵茯苓菌丝体:用ＮＢＳＢｉｏｆｌｏⅢ发酵罐液体发酵5ｄ后停止发酵,茯苓发酵液离心分离后60℃烘干。液体发酵条件为:发酵温度26℃,ｐＨ5.5,搅拌转速和通气量根据溶氧水平的高低而调整。天然茯苓:购于成都中药材市场。

1.2　主要仪器与试剂离心机:ＢｅｃｋｍａｎＪ2 ＨＳ;匀质机:ＡＰＶ;电子天平:ＳａｒｔｏｒｉｕｓＢＰ121Ｓ。葡萄糖化学对照品(中国药品生物制品检定所),氯仿、丁醇、乙醇、丙酮、乙醚和ＮａＯＨ等试剂均采用国产分析纯。

2　方法

2.1　发酵茯苓菌丝体和天然茯苓中茯苓多糖的提取

2.1.1　样品的处理将发酵茯苓菌丝体和天然茯苓60℃烘干至恒重,用粉碎机粉碎,过80目筛后,再将发酵茯苓菌丝体和天然茯苓60℃烘干至恒重,干燥器中保存。

2.1.2　样品的称量用电子天平分别精确称取发酵茯苓菌丝体和天然茯苓菌粉20ｇ。

2.1.3　发酵茯苓菌丝体和天然茯苓中多糖的提取[6]笔者采用水煮法、水回流提取法、浓碱浸提法、稀碱浸提法,分别对天然茯苓和发酵茯苓菌丝体进行提取。结果表明采用稀碱浸提法所得茯苓多糖的提取率最高。同时,笔者结合水回流提取法和稀碱提取法两者的优点,又通过实验进一步优化了茯苓多糖的工艺参数(水回流提取时间、ＮａＯＨ溶液浓度、ＮａＯＨ溶液浸提时间及温度),确定了茯苓多糖的最佳提取工艺。发酵茯苓菌丝体和天然茯苓中多糖的提取工艺见图1,所得的茯苓多糖用电子天平精确称量。

2.2　发酵茯苓菌丝体和天然茯苓中总糖的含量测定用苯酚 硫酸法测定糖含量[7],以葡萄糖化学对照品为对照标准品。

3　结果与分析

3.1　发酵茯苓菌丝体和天然茯苓中多糖的提取从20ｇ发酵茯苓菌丝体中提取分离得到水溶性茯苓多糖1 372ｇ,提取率6 86%;得到碱溶性茯苓多糖3 522ｇ,提取率17 61%。从20ｇ发酵茯苓菌丝体中提取分离得到总多糖4 894ｇ,提取率24 47%。从20ｇ天然茯苓中提取分离得到水溶性茯苓多糖0 47ｇ,提取率2 35%;得到碱溶性茯苓多糖16 116ｇ,提取率80 58%。从20ｇ商品茯苓中提取分离得到总多糖16 586ｇ,提取率82 93%。从20ｇ天然茯苓中提取分离得到的总多糖16 586ｇ远高于从20ｇ发酵茯苓菌丝体中提取分离得到的总多糖4 894ｇ。笔者认为发酵中药茯苓和天然茯苓在生长环境、生长条件等方面大不相同,因此,二者的代谢途径和代谢产物应有所差异,总多糖的提取率有较大差异就理所当然了。另外,茯苓液体发酵时,除茯苓菌丝体的大量繁殖外,同时还向液体培养基分泌了大量的胞外多糖(每升发酵液中茯苓胞外多糖的含量5 43ｇ高于胞内多糖的含量4 09ｇ),而发酵液中的胞外多糖并未包括在发酵茯苓菌丝体的总多糖里。

值得注意的是,发酵茯苓菌丝体和天然茯苓在水溶性多糖和碱溶性多糖的比例方面也有所差异。20ｇ发酵茯苓菌丝体水溶性茯苓多糖1 372ｇ(提取率6 86%)远高于20ｇ天然茯苓水溶性茯苓多糖0 47ｇ(提取率2 35%),而水溶性多糖较碱溶性多糖具有较强的生理活性。今后加强发酵茯苓菌丝体和天然茯苓所含的水溶性多糖和碱溶性多糖的结构特征和生理活性的对比研究,进一步筛选出活性更强的茯苓多糖。发酵茯苓菌丝体和天然茯苓多糖提取采用水提醇沉和碱提醇沉法进行。影响茯苓多糖提取率的因素很多,如:浸提温度、时间、多糖浓度、ＮａＯＨ溶液浓度以及脱杂质的方法都会影响茯苓多糖的提取率。笔者所选用茯苓多糖提取分离的条件主要是依据实验研究和参考文献,但这并不一定是茯苓多糖提取分离的最佳条件。另外,对发酵茯苓菌丝体和天然茯苓多糖的提取还仅仅只是将其初分为水溶性多糖和碱溶性多糖两类,今后有待通过柱层析等分离手段将多糖组分进行分级,并进一步分析其单糖组成和结构特征。

3.2　发酵茯苓菌丝体和天然茯苓中总糖的含量测定

发酵茯苓菌丝体和天然茯苓中总糖含量测定结果见表1。]

　　从表1可知,发酵茯苓菌丝体和天然茯苓总糖含量的ＲＳＤ分别为1 441%和0 722%,表明发酵茯苓菌丝体和天然茯苓总糖的平均含量测定结果均良好。天然茯苓总糖的平均含量87 24%远高于发酵茯苓菌丝体总糖的平均含量45 17%。笔者认为发酵茯苓菌丝体和天然茯苓由于在生长环境、生长条件等方面存在较大的区别,二者在总糖的平均含量方面存在较大差异也就顺理成章了。发酵茯苓菌丝体和天然茯苓中总多糖的提取率分别为24 47%和82 93%,而与此相对应的总糖平均含量分别为45 17%和87 24%。笔者认为二者在总多糖的提取率和总糖平均含量方面之间存在着较大差异,一方面可能因为茯苓多糖的提取工艺更适合于天然茯苓总多糖的提取,而发酵茯苓菌丝体总多糖的提取工艺还有待进一步优化;另一方面可能因为发酵茯苓菌丝体中总多糖占总糖的比例低于天然茯苓中总多糖占总糖的比例(发酵茯苓菌丝体中单糖和寡糖占总糖的比例高于天然茯苓中单糖和寡糖占总糖的比例)。

4　讨论

据国内外研究报道,天然茯苓中含有的化学成分较为复杂,主要含茯苓多糖。茯苓多糖分子中主要是结构是β(1 3) Ｄ 葡聚糖,糖链上分布有少量的β(1 6) Ｄ 葡萄糖侧链。抗肿瘤实验表明,茯苓多糖无抗肿瘤活性,将茯苓多糖中β(1 6)结合的葡萄糖单位用Ｓｍｉｔｈ降解法去掉,即得到具有抗肿瘤活性的茯苓次多糖。该多糖还具有增强巨噬细胞和Ｔ淋巴细胞的细胞毒性作用。因此,茯苓中的活性成分为结构改造的茯苓次多糖。茯苓次多糖进一步羧甲基化就得到有较好水溶性和较高生物活性的羧甲基茯苓多糖[6]。Ｎａｒｕｉ等[8]报道从发酵茯苓菌丝体中分离出来的多糖与从天然菌核中分离出来的多糖相比,二者的结构几乎相同,主要为β(1 3) Ｄ 葡聚糖,带少量支链;丁琼等[9]报道发酵茯苓菌丝体中多糖的化学组成和结构基本同于茯苓菌核多糖。因此,发酵茯苓菌丝体和天然茯苓在化学组成和结构方面具有较大的相似性,通过液体发酵培养菌丝体可部分代替野生子实体,用来加工成营养保健品及开发生物药物是切实可行的。同时,也应注意到由于发酵茯苓菌丝体和天然茯苓在生长环境和生长条件等方面均存在较大的差异,在总多糖的提取率及总糖的平均含量方面二者均有所差异,在具有较强生理活性的水溶性多糖占总多糖的比例方面二者也有较大差异(水溶性多糖较碱溶性多糖更易于被人体吸收因而有更强的生理活性)。因此,今后应加强发酵茯苓菌丝体和天然茯苓中水溶性多糖和碱溶性多糖的结构特征和生理活性的对比研究。致谢:本论文得到西南交通大学李萍副教授和成都中医药大学裴瑾博士的热心指导,得到成都地奥制药公司吴洽庆博士的大力帮助,在此一并致谢。