多糖的结构分析与构效关系
2007-04-28 23:39:14   来源：海峡药学   评论：0 点击：

　　多糖(polysacchatide)几乎存在于所有的生物体中,在生命过程中表现出广泛的功能。比如,构成动物、植物和微生物的细胞外结构物质如纤维素和几丁质,作为能量物质如淀粉和糖原,而且还作为生命过程中起核心作用的分子如遗传物质、酶、抗体、激素、膜蛋白和脂类的不可缺少的组成部分〔1〕。早在上世纪40年代就发现了多糖类物质的抑癌效应,特别是上世纪60年代以来逐渐发现了多糖对肿瘤、肝炎、心血管病、糖代谢和抗衰老等方面具有一些独特的生物活性,同时毒性极低,几乎没有直接的细胞毒作用〔2〕。因此深入研究多糖的结构、生物活性以及构效关系,可推动多糖类新药的发现与研究。

1　结构分析多糖是由醛糖和(或)酮糖以糖苷键连接在一起的多聚物(polymer),可分为同型多糖(homosaccharide)和异型多糖(heterosaccharide)两大类。对多糖结构研究常采用的方法有分子量测定、单糖组成、高碘酸氧化和Smith降解、甲基化分析以及物理分析方法等,特别是物理分析方法,以其独特的优势而被越来越多地采用。

1.1　分子量测定　多糖的分子量测定是研究多糖性质的一项重要工作,多糖的性质往往与它的分子量的大小有关。在测定分子量时,为了避免因存在杂质而影响测定结果,需把待测样品适当纯化。常采用的测定分子量的方法有以下几种:1高效液相色谱法〔3〕,多是高效体积排阻色谱(HPSEC),样品分子与凝胶之间无相互作用,完全按照分子筛原理分离。多糖样品不需衍生化,而是直接上样检测。2粘度法测定多糖分子量,所需设备简单,操作较易于掌握,先测定样品特性粘度η,然后通过换算方程,即经验公式η=KMα,计算分子量。3渗透压法,利用膜渗透压计(nfelllbranemsmometer,MO)可测定范围在1×104～5×105之间的多糖分子量,不需要标准品。4蒸汽压法利用蒸汽压渗透计(vaporpressureosmometer,VPO)可测定分子量范围在500～10,000之间的多糖分子量,本方法简便快速。另外还有超过滤法、凝胶过滤法、光散射法和端基法等。

1.2　单糖组成　一般将多糖在三氟乙酸作用下水解,检测水解产物中的单糖组分,常采用检测方法有纸层析(PC)、薄层层析(TLC)和气相色谱(GC)等。经典的PC和TLC不够灵敏,气相色谱法和现代毛细管气相色谱法的广泛应用使得多糖的分析更加简便快捷。高效液相色谱法今年来也用于单糖与低聚糖的分析,可直接上样不需衍生化,操作简便有较高的分辨率。

1.3　高碘酸氧化和Smith降解　高碘酸可选择性断裂糖分子中的邻二羟基或邻三羟基处,生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。反应定量进行,每开裂1个C-C键消耗1分子高碘酸。通过测定高碘酸的消耗量及甲酸的释放量,可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度、分支多糖的分支数等。Smith降解是将高碘酸氧化产物还原后酸水解,再鉴定水解产物,从而推断糖苷键的位置与分支点等。以葡萄糖为例,以1→2或1→4位键合的糖基经高碘酸氧化,平均每个糖基消耗1分子高碘酸,且无甲酸释放;1→3位键合的糖基不被高碘酸氧化;1→6位键合的糖基或非还原末端糖基经高碘酸氧化,消耗2分子高碘酸同时释放1分子甲酸。

1.4　甲基化分析　甲基化分析可用于阐明多糖中各单糖间的连接方式。分析步骤是先将多糖中单糖残基中的游离羟基转变为甲氧基,进而水解成各种甲氧基单糖,然后还原成相应的阿尔迪醇(alditol),再乙酰化,得到部分甲基化部分乙酰化的单糖醇,进行GC-MS分析。从GC的保留时间和质谱图谱,与标准品对照,判断糖的组成和连接方式。甲基化反应的方法有Hakomori、Haworth和Cuicanu-Kerek法等。

1.5　物理分析方法　多种物理分析方法可提供多糖的一级结构和空间结构的重要信息。

1红外光谱法〔4〕在多糖的结构分析中可用于确定判断其主要官能团,如-OH,C-O-C,C=O,-NH2等,且直接判断呋哺糖的糖苷键构型,如含有甘露糖残基,则出现810cm-1和870cm-1的特征吸收峰。2核磁共振(NMR)分析:1H-NMR主要用于确定糖苷键的构型,13C-NMR在多糖结构上的分析比1H-NMR广,化学位移可达200ppm,共振信号分得较开,容易分辨,因而在多糖的分析中起重要作用。3质谱法(MS)通过该方法可得到序列分析和结构鉴定的重要信息,早期使用电子轰击质谱法,新的电离方法有化学电离(CI)、场解析(FD)、二次电离(SI)、快原子轰击(FAB)和激光解析(LD)等。其他还有旋光度测定、圆二色谱法和X射线衍射分析等。

2　构效关系多糖的构效关系是指多糖的一级结构和高级结构以及理化性质与其生物活性的关系。对多糖的研究显示,多糖的各种生物活性与其结构、构象等有着密切的关系。目前对多糖构效关系的研究主要包括以下几个方面:物理性质、一级结构和空问结构与多糖活性的关系。

2.1　物理性质　多糖的物理性质与其活性有关。1溶解度。如β-(1→3)-D-葡聚糖不溶于水,将其部分羧甲基化后,水溶性提高,则它的抗肿瘤活性也明显提高〔5〕。但是也有相反的报道。2粘度。裂褶多糖是很有应用前景的抗肿瘤药物,但起初因为粘度太大,无法应用于临床,后通过控制性超声波处理,部分解聚,使分子量降低,粘度减小,但由于其基本重复结构不变,还保持抗肿瘤活性〔6〕。3相对分子质量。分子的大小是多糖具备生物活性的必要条件,这可能与保证高级结构的构象有关。JagodzinshiPP报道高分子量右旋糖苷促培养的单核细胞合成IL-8,这是其促进单核细胞分泌IL-1β和17NF-a的结果,而低分子量右旋糖苷无此作用〔7〕。有报道说多糖相对分子质量在10～20万之间活性最强,5000～10000的多糖不具备生物活性。但此种说法似乎不能做为定论〔8〕。

2.2　一级结构

2.2.1　糖基的组成与糖苷键的类型:不同种类的多糖,其主链糖基组成和糖苷键类型不同,生物学活性存在较大差异。如香菇多糖是以(1→3)葡聚糖主链结构,具有抗肿瘤作用及提高细胞免疫及体液免疫功能〔9〕,而同是葡聚糖主链的淀粉,其糖苷键为(1→4)键型,却没有生物学活性,这在一定程度上源于二者主链糖苷键的类型不同。银耳多糖主链为α-(1→3)糖苷键连接的甘露聚糖,具有免疫调节、抗肿瘤、抗凝血、抗血栓等作用;从酵母细胞壁中得到的甘露聚糖能抑制人体细胞突变和抗氧化的活性〔10〕。冬虫夏草多糖的单糖组成为甘露糖、半乳糖、葡萄糖,其具有提高机体免疫功能,抑制肿瘤细胞的作用,并能改善化疗引起的不良反应。

2.2.2　支链的长度、取代度和位置:如茯苓多糖由于支链过长而不具有抗肿瘤活性,需经过控制性氧化水解,降低支链长度,才具有活性。带支链的菌多糖抗肿瘤的生物活性也取决于支链化的程度,支链化程度超过4个糖基时,就会失去生物活性。支链化程度越大,生物活性越弱〔11〕。食药用菌活性多糖β-(1→3)-D-聚糖,分支度在0.2～0.33时生物活性较强〔12〕。PMII是一种从PlantagomajorL的叶子中分离出来的多糖,具有抗补体的活性,移去末端连接到半乳糖上的阿拉伯糖可以增加活性,但移去连接在主链聚半乳糖醛酸上的阿拉伯糖则降低了活性。

2.2.3　取代基的种类和取代度:实验证明,硫酸盐阴离子是硫酸化多糖抗病毒必须的离子结构。如小分子量的牛膝多糖有增强免疫作用,但无抗病毒的活性,引入一定量的硫酸基团后,有了较强的抗乙型肝炎病毒HBV的活性。香菇多糖有抗肿瘤活性,硫酸化后还具有抗HIV活性,能抑制HIV所致的细胞病变〔13〕。

2.3　空间结构　一般认为,呈屈状螺旋的多糖活性较高,而呈可拉伸带状或皱纹型带状的多糖活性一般较低甚至没有活性。三股螺旋构型是多糖最具活性的空间构像。茯苓多糖(Pachyman)是β-1,3-葡聚糖,单线螺旋结构不具活性,如果通过化学方法制备羧甲基衍生物即羧甲茯苓多糖,或在尿素存在下加热反应得到尿素茯苓多糖,这两种衍生物便具有显著的抗肿瘤活性,X-衍射分析发现它们的立体结构从单股螺旋变成三股螺旋。另外,X-衍射分析表明具有抗肿瘤活性的香菇多糖呈三股螺旋结构,具有免疫活性的裂褶多糖也能形成类似三股螺旋的对称螺旋结构。当向香菇多糖中添加尿素或二甲亚砜,使其失去其三股螺旋构像,改变空间构型,其生物活性也随之消失〔14〕。而向水不溶的裂褶多糖中添加尿素或氢氧化钠,则可诱导产生规则的空间构像,从而表现出抗肿瘤活性。这些都说明,规则的空间构像与多糖的生物学活性密切相关。随着化学、物理学、计算机科学、生物学、生物化学、免疫学等多个学科的发展,随着多糖的资源挖掘的深入,对多糖的结构分析、结构改造、合成机理及控制、药理作用、构效关系等各个方面都将会有较大的突破,必将推动多糖类新药的研究与开发。