单子叶植物内生菌多糖抗肿瘤活性的研究
2008-03-16 18:21:49   来源：本站原创   评论：0 点击：

植物内生菌广泛存在于各种植物中，其分布广、种类多。有关植物内生菌生物活性物质在医药领域的应用研究是目前的一个研究热点，内生菌可产生丰富多样的次生代谢产物，许多研究结果表明植物内生菌代谢产物具有抗肿瘤、抗菌、抗炎症、免疫调节、降糖等多种生物活性［1～4］。单子叶植物内生菌是一种新发现的植物内生菌，其产生的多种生物活性物质在医药方面可能具有重要的应用潜力。关于单子叶植物内生菌多糖提取物（简称内生菌多糖）药物作用的相关研究极少。为此，本研究将对单子叶内生菌菌体多糖抗肿瘤活性进行初步探讨。

　　1材料与方法

　　1.1材料单子叶植物内生菌由中国科学院武汉植物研究所张正荃研究员惠赠。BALB/c纯系小鼠，8～12周龄，体重20±1g，雌雄兼用，由武汉大学医学实验动物中心提供。小鼠肝癌H22细胞株由北京市肿瘤研究所提供;S-180肉瘤细胞株，由武汉大学医学院免疫系提供。试剂:RPMI1640（GIBCO），噻唑蓝（MTT）。CO2细胞培养箱为德国Heraeus公司产品。

　　1.2方法

　　1.2.1内生菌多糖提取 将内生菌接种培养基琼脂斜面上28℃培养48h，接种于100ml培养基中（500ml三角瓶装），28℃振荡培养48h，然后转种至发酵培养基中（接种量为10%），在28℃振荡摇档上培养96h，生物活性最高，随即放瓶提取。取细菌发酵液（15000g、离心25分钟）洗涤3次，加入3倍体积的95%冷乙醇，4℃过夜;5000g、20min、收集上清、弃细菌，加入KCl （终浓度1%w/v），加入3倍体积的95%冷乙醇重复提取3次，加入蒸馏水，上大孔吸附树脂，收集流出液，冷干浓缩。冷干品用适量水溶解，上DEAE-SephadexA25柱，收 集流出液，冷干，用适量水溶，以75%乙醇沉淀，收集沉淀。沉淀用水溶后，装入透析袋透析，收集袋中液体。多糖的鉴别: ①茚三酮反应为阴性，α-萘酚反应为阳性; ② UV（λmaxH2 O，nm）:198.8; ③ SDS-PAGE电泳:以10～15V/cm电压进行电泳，结果显示无明显条带，证明内生菌多糖不含蛋白质。样品用生理盐水和RPMI1640培养液配成20g/L，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存，临用前用培养液稀释到所需浓度。

　　1.2.2内生菌多糖体内抗肿瘤实验 ①取接种7d生长良好的腹水型S-180荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，取腹水，用生理盐水稀释成每毫升含1×107 个瘤细胞的悬液，接种于实验小鼠右前肢腋窝皮下，每只小鼠接种0.2ml瘤细胞悬液。将接种S-180肉瘤的小鼠随机分为生理盐水组、实验组和环磷酰胺阳性对照组，标号并称重。接种S-180肉瘤细胞后24h，生理盐水组每只小鼠隔天连续给与实验组给药容积相等的生理盐水1次;实验组每只小鼠隔天按50与100mg/kg剂量给药1次;阳性对照组给予环磷酰胺，每只小鼠隔天按30mg/kg剂量给药1次。各组小鼠于实验的第12天，分别颈椎脱臼处死，完整剥出瘤体，称重，计算抑瘤率。 ② 内生菌多糖抑制小鼠肝癌H22的实验:方法同上。

　　1.2.3内生菌多糖体外抗肿瘤实验 分别取接种7d生长良好的腹水型S-180肉瘤小鼠和腹水型H22肝癌的小鼠，颈椎脱臼处死，取腹水，用生理盐水稀释成每毫升含1×106 个瘤细胞的悬液， 以每孔400μl接入48孔培养板，24h后加药50μl，使多糖浓度分别为25μg /ml、50μg /ml、100μg /ml，同时设环磷酰胺阳性对照组，使其浓度为30μg /ml，阴性对照组加相应体积的含10%新生牛血清RPMI 1640培养液，培养48h后，每孔加MTT40μl，继续孵育4h，弃上清，加入酸化异丙醇40μl，终止反应，转至酶标板上，490nm测定吸光度。

　　1.2.4内生菌多糖对小鼠S180肉瘤生长及存活期的影响 荷瘤小鼠模型方法同上。将接种S-180瘤细胞的小鼠随机分为生理盐水组、实验组和阳性对照组，标号并称重。接种S-180瘤细胞后24h，生理盐水 组每只小鼠隔天连续腹腔注射与实验组给药容积相等的生理盐水1次;实验组每只小鼠隔天按50、100与200mg/kg剂量给药1次;阳性对照组每只小鼠隔天按30mg/kg剂量给药1次。连续给药5天，第6天分别称重，计算体重增重比，继续饲喂，自接瘤之日起，记录死亡时间。

　　1.2.5内生菌多糖抑制对小鼠S-180腹水瘤细胞分裂指数的影响 常规接种S-180腹水瘤细胞24h后， 实验组隔天按50mg /kg; 阳性对照组每只小鼠隔天按30mg/kg剂量给药1次; 生理盐水组每只小鼠隔天连续腹腔注射与实验组给药容积相等的生理盐水1次。连续注射4次，每次注射8h后抽取腹水，用改良苯酚品红染色，显微镜下随机记数1000个细胞中处于中期分裂相的细胞数，计算有丝分裂指数。

　　1.3统计学处理所有数据均以 x±s表示，不同实验间差异用t 检验，采用SAS软件处理。

　　2结果

　　2.1内生菌多糖对小鼠S-180肉瘤、小鼠肝癌H22的影响由表1和表2可以看出， 内生菌多糖浓度为50mg/kg、100mg/kg时， 对小鼠S-180肉瘤抑瘤率可达62. 84%和 65.08%， 对小鼠肝癌H22抑瘤率可达66. 14%和67.93%，与生理盐水对照组比较有显著的抑瘤效果（ P <0.01）。

　　表1 内生菌多糖对小鼠S-180瘤株生长的影响（略）

　　注:* 与NS组比较， P <0.01。

　　表2 内生菌多糖对小鼠肝癌H22瘤株生长的影响（略）

　　注:* 与NS组比较， P <0.01。

　　2.2内生菌多糖对小鼠S-180肉瘤、小鼠肝癌H22细胞体外增殖的影响内生菌多糖对S-180肉瘤、小鼠肝癌H22细胞体外增殖的影响结果见表3、表4， 内生菌多糖对S-180肉瘤、小鼠肝癌H22细胞体外增殖有一定抑制作用，在25～100μg/ml范围内与浓度呈正相关，与生理盐水对照组比较有显著的抑瘤效果（ P <0.01）。

　　表3 内生菌多糖对小鼠S-180肉瘤细胞体外增殖的影响（略）

　　注:* 与NS组比较，* P<0.05，** P<0.01， *** P <0.001。

　　表4 内生菌多糖对小鼠肝癌H22细胞体外增殖的影响（略）

　　注:* 与NS组比较，* P<0.05，** P<0.01 。

　　2.3内生菌多糖对小鼠S-180肉瘤生长及存活期的影响由表5可知按内生菌多糖剂量为25、50、100mg/kg时，小鼠腹水瘤平均体重增重比较对照组分别降低了5.53%、8.56%、10.15%，延长平均存活天数分别为:3.2、5.9、5.4天。

表5 内生菌多糖对小鼠S-180肉瘤鼠腹水增重及存活期的影响（略）

　　注:* P<0.05，** P<0.01 。

　　2.4内生菌多糖对S-180肉瘤细胞有丝分裂指数的影响表6结果显示， 内生菌多糖组的S-180小鼠腹水瘤细胞分裂指数前4天有明显下降趋势，与环磷酰胺组相比，有相似的下降趋势。但在第4天，分裂指数趋于稳定，以环磷酰胺组分裂指数最低，表明肿瘤生长初期，瘤细胞经过一个快速分裂时期后，由于细胞间相互抑制作用，生长趋于稳定。内生菌多糖和抗肿瘤药物环磷酰胺一样可起到一定抑制肿瘤生长的作用。

　　表6 内生菌多糖对小鼠S-180肉瘤细胞分裂指数（%）的影响（略）

　　3讨论
 
　　多糖是一类广泛存在于高等植物、真菌、藻类、细菌和动物细胞膜上的生物大分子物质。多糖不但是生物体的主要结构成分，还具有复杂的生物活性与功能。多糖抗肿瘤作用的机理研究已经成为多糖研究的一个热点［5］。植物内生菌是一种多样性十分丰富的微生物类群，它们生活在健康植物的各种组织和器官的细胞或细胞间隙内而不引起植物病变，是与寄生植物在长期的共同进化过程中建立起互惠共存相互制约的和谐联合关系的一类微生物［6］。植物内生菌的存在和作用长期以来被人们忽视，很少有人涉足这方面的研究。1993年Stierle［7］等人首次从短红豆衫的韧皮中分离到一株能产抗癌物质紫杉醇的内生真菌。目前有关植物内生菌的研究十分活跃，一些学者对植物内生菌在医药方面也进行了大量的探索研究，内生菌的抗肿瘤活性物质也有许多新发现和新进展。单子叶植物内生菌是从植物百合中分离的一种胞内寄生菌，广泛存在于单子叶植物中，是迄今为止发现的植物内生菌中少数胞内寄生菌之一，富含一些新的生物成分。因此本研究对单子叶植物内生菌多糖抑制肿瘤细胞生长的作用进行了初步探讨。单子叶植物内生菌多糖具有一定的抗肿瘤作用。体外抑癌实验结果表明单子叶植物内生菌多糖可抑制小鼠H22肝癌细胞、小鼠S-180体外增殖，其抑癌效果与剂量呈正相关。体内抑瘤实验结果表明，单子叶植物内生菌多糖对小鼠S-180实体瘤和小鼠H22肝癌腹水瘤都具有抑制作用，单子叶植物内生菌多糖可以干扰肿瘤细胞的细胞周期，抑制其分裂，可部分阻止S-180细胞进入分裂期。单子叶植物内生菌多糖的抑瘤作用可能是通过增强体内免疫功能和直接抑制肿瘤细胞的分裂而实现的。单子叶植物内生菌多糖对肿瘤细胞的杀伤机制也可能有多种不同的途径:①激活体内免疫系统，促进抗肿瘤活性;②细胞调亡:抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化或凋亡是抗肿瘤药物重要作用机制之一;③直接的细胞毒作用:本 研究发现单子叶植物内生菌多糖可干扰肿瘤细胞的细胞周期，抑制其分裂，可部分阻止S-180细胞进入分裂期;④抗肿瘤发生相关基因突变作用。本研究的结果表明:单子叶植物内生菌多糖具有抗肿瘤活性。单子叶植物内生菌多糖作为一种微生物新资源，其多糖在抗肿瘤作用方面具有重要的应用潜力，今后我们将对单子叶植物内生菌多糖抗肿瘤的有效成分以及确切作用机制进一步深入研究。

【参考文献】
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　　3 Stierle A，Stierle D"Bugni T，et al.Sequoiatone A and B novel anti-tumor metabiolites isolated from a redwood endophyte.Org Chem，1999，64:5479～5484.

　　4 Xiao Gao，Hui Zhu，Daiying Xu，et al.High diversity of endophytic fungi from the phamaceutical plant Hetercsmilax japonica kunth re-vealed by cultivation-independent apprcach，FEMS Microbiology letters ，2005，249:225～226.

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