醋杆菌产纤维素发酵条件的优化
2006-09-17 16:56:46   来源：不详   评论：0 点击：

    细菌纤维素，也称微生物纤维素，是一种新型的生物材料，是近年来生物材料研究开发的热点之一。Ｂｒｏｗｎ 于１８８６年首次发现并报道，当木醋杆菌Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ静止培养时在培养基与空气界面产生的一层白色膜状物质——细菌纤维素。细菌纤维素由于具有纯度高，强度高，亲水性好等特点，在食品、造纸、声音振动膜、人造皮肤的制造及造纸行业有着广泛的应用前景。由于纤维素合成酶基因的不稳定性，一般情况下细菌纤维素由 Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ 静止浅盘培养产生，但是这种方法存在一些弊端，如浅盘表面积大易造成发酵液大量挥发损失，生长缓慢发酵时间长等等，这些都导致了成本的提高。近年来，人们致力于选育能够通气搅拌培养的Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ 菌株，以提高纤维素产量，降低成本。本实验室最近筛选到一株在搅拌培养条件下，能高产纤维素的 Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ菌株。
１ 材料与方法
１．１ 材料
    菌种　　　Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ　Ｃ２（本实验室保藏） 。
    培养基　　蔗糖７％，酵母膏０．７％，蛋白胨１．１％，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．２％，柠檬酸三钠０．１％ 。
    培养条件　２９℃，摇瓶培养６ｄ。
    主要仪器　摇瓶培养箱，真空循环水泵等。
    主要试剂　蔗糖，蛋白胨，酵母膏，柠檬酸钠，Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４ 等。
１．２ 纤维素产量的测定
    细菌纤维素收获后，以布氏漏斗抽滤除去纤维素中的培养基并用去离 子 水 反 复 洗 涤 。将纤维素悬于４％ＮａＯＨ 溶液，１００℃保温２０ｍｉｎ以除去菌体。用去离子水和 ０．５％ 乙酸溶液连续洗涤纤维素至中性。纤维素在８０℃干燥 １～２ｈ 后称重。
１．３ 最佳发酵温度的确定
    使用基础培养基，分别在室温（约 ２４℃）、２７、３０、３３、３６℃培养 Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ　Ｃ５，６ｄ 后测定细菌纤维素产量，比较温度对产量的影响。
１．４ 最佳ｐＨ 值的确定
    在发酵过程中，培养基的 ｐ Ｈ 值并非恒定的，而是随发酵过程不断变化，因此本实验只是进行对最佳的初始ｐＨ 的确定，选择范围在 ｐＨ３．０～７．０ 之间。使用基础 培养基，２７℃培养Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ　Ｃ５，６ｄ 后测定细菌纤维素产量，比较 ｐ Ｈ 对纤维素产量的影响。
１．５ 最佳装液量的确定
    分别在不同容积的烧杯中装入不同体积的基础培养基，培养６ｄ 后测定细菌纤维素产量，比较培养基液面积和液深对纤维素产量的影响。
１．６ 最佳转速的确定
    在静止和不同转速条件下振荡培养ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｍＣ２，６ｄ 后测定细菌纤维素产量，比较转速对纤维素产量的影响。
１．７ 发酵周期的确定
    使用基础培养基在２７℃培养Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ　Ｃ２，从第２４ｈ 起，每１２ｈ 测定一次细菌纤维素产量，绘制纤维素产量变化曲线，比较发酵时间对纤维素产量的影响。
２ 结果与讨论
２．１ 最佳温度的选择
    使用最佳发酵培养基，对发酵温度测定结果如图１所示。由图１可看出，Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ　Ｃ２在２７℃发酵生产细菌纤维素的产量最高，而２７～３０℃是产生纤维素的最适温度范围。当培养温度达到 ３６℃时，ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｍＣ２细胞不能生长，细菌纤维素完全不能产生。

    
２．２ 最佳 ｐＨ 的选择
   在最佳发酵温度下，对最佳发酵ｐＨ 的测定结果如图２所示。由图２可看出，Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍＣ２ 发酵生产细菌纤维素的最适 ｐＨ 范围在 ４．０～４．５ 之间。超出这一范围，则纤维素的产量大幅下降。随着发酵液起始 ｐＨ 的升高，发酵液终点的ｐＨ 也不断升高。这和另一株菌 Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍＣ５的特性不太一样，无论Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍＣ５发酵液起始的ｐＨ是多少，其发酵终点的 ｐＨ 都在 ３～４ 之间。

  
２．３ 最佳装液量的选择
     分别在 ２５０ｍｌ三角烧瓶和５００ｍｌ三角烧瓶中装入５０～３５０ｍｌ 体积不等的培养基，分别在静止和振荡条件下培养Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ　Ｃ２，以测定供氧量对该菌生长的影响。测定结果如图３及图４所示。由图３和图４可以看出，无论是２５０ｍｌ 三角烧瓶还是５００ｍｌ三角烧瓶，无论静止培养还是振荡培养，纤维素产量变化的趋势是相同的。即随装液量的增加，细菌纤维素的产量都是逐渐下降的。

２．４ 转速的影响
    分别在静止和不同转速情况下培养Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍＣ２，测定的细菌纤维素产量如图５所示。比较图中数据可以知道，Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍＣ２在静止和相对低的转速（１６０ｒ／ｍｉｎ）条件下发酵生产细菌纤维素的产量比较高。在高转速下，细菌纤维素也能产生，但是产量相对较低。 静止培养和摇瓶培养所得到的纤维素的形态是不一样的。静止培养得到的细菌纤维素为薄膜状凝胶，而振荡培养得到的纤维素呈团块状，当培养液很多时，纤维素会呈细碎的米粒状。
２．５ 发酵终点的选择
   采用最佳发酵培养基，ｐＨ 值为４．５，装液量为５０ｍｌ发酵液／２５０ｍｌ 三角瓶，在２７℃，１６０ｒ／ｍｉｎ 摇瓶培养，测定纤维素产量变化曲线，并以此确定发酵终点。结果如图６ 所示。在最初培养的２４ｈ，看不到明显的纤维素产生。从３６ｈ开始，培养液中有丝状或条状的纤维素产生。此后纤维素产量不断增加，纤维素纠结在一起形成团块状。至２０４ｈ 产量达到最大值，此后产量在平稳中有所下降。因此确定Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ　Ｃ２发酵生产细菌纤维素的终点为２０４ｈ。