在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略
2007-10-24 22:49:13   来源：本站原创   评论：0 点击：

蛋白质的蛋白酶解
蛋白酶解是一个选择性的、高度调节的过程，该过程参与许多代谢活动。E.coli在细胞质、细胞外周质、内膜和外膜有许多蛋白酶[180，181]。这些蛋白酶参与宿主的代谢活动，如选择性地清除异常和错误折叠的蛋白。到目前为止，蛋白酶解的机制尚未完全明了，但已有一些策略和方法以减少E.coli中异源蛋白的降解。虽然使得蛋白质不稳定的精确结构特点还不清楚，但是通过系统研究已经明确了一些蛋白不稳定的决定因素。蛋白酶解途径的“N-末端规则”在E.coli中能够发挥作用，即蛋白质的稳定性与其氨基端的残基有关[182]。在E.coli中，Ｎ－末端Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr和Trp的半衰期为２分钟，而除脯氨酸外的其他氨基酸的半衰期均超过10小时。有研究表明，在多肽的第二位带有较小侧链的氨基酸有利于甲硫氨酸氨肽酶催化的N-末端甲硫氨酸的去除，从而暴露出位于第二位的亮氨酸，使得该蛋白不稳定[183]。蛋白质的第二个决定因素是位于近氨基端的特异性内源赖氨酸残基[142，143]。该残基是多遍在蛋白链的受体，多遍在蛋白链在真核细胞中有利于遍在蛋白依赖的蛋白酶对蛋白质的降解。有趣的是在一个多遍在蛋白中，它的两个决定簇可以位于不同的亚基上，却能靶向同一个蛋白进行加工[184]。 氨基酸成分和蛋白质不稳定性的另一个关系体现在PEST假说中[185]。根据对短寿命真核蛋白的统计分析，蛋白质如果富含Pro、Glu、Ser和Thr的区域，且在该区域附近有某些特定的氨基酸，则该蛋白就会不稳定。这些PEST结构域的磷酸化导致钙的结合能力提高，从而利于钙依赖性蛋白酶对蛋白质的降解。这提示可以在缺乏PEST蛋白裂解系统的E.coli中表达PEST富含蛋白。
减少E.coli中重组蛋白裂解的策略有以下几种：（1）将蛋白质靶向细胞周质或培养基[145，186]；（2）在较低的温度下培养细菌[187]；（3）选用蛋白酶缺陷的菌株[188]；（4）构建N-末端或C-末端融合蛋白[186]；（5）将目的基因多拷贝串联[188]；（6）与分子伴侣共表达[189]；（7）与T4 pin基因共表达[190]；（8）替换特定的氨基酸残基以消除蛋白酶裂解位点[191]；（9）改善蛋白质的亲水性[192]；（10）优化培养条件[193]
 
 融合蛋白表达
在E.coli中表达外源蛋白，尤其是真核蛋白时，蛋白质的稳定性是经常遇到的问题。最近几年，众多巧妙的蛋白质——融合系统的发展，为E.coli中高效表达和纯化重组蛋白提供了极大方便。融合表达具有多方面的优点：如防止包涵体的形成，促进蛋白质的正确折叠，限制蛋白酶解和利于纯化[159，194]。
Uhlen和其同事[195]利用葡萄球菌A蛋白和合成的结构域（Z）开发了一种多功能的融合伴侣，除了能够作为纯化标记外，A蛋白组分还作为一种可溶性伴侣促进蛋白质的折叠，A蛋白信号肽的存在可使表达蛋白分泌到培养基中。另一个融合伴侣是链球菌G蛋白（SPG），它是一种细菌胞壁蛋白，在其氨基端具有分离的白蛋白结合区，在OH端具有免疫球蛋白IgG结合区[196]。最小的白蛋白结合区由来源于SPG的46个氨基酸残基组成，作为亲和纯化标记纯化cDNA编码的蛋白。如果将A蛋白和SPG结构域联合组成三联融合蛋白，则为纯化提供了更为广泛的选择，可以更进一步防止蛋白酶解。SPG-白蛋白的一个重要应用是其能够稳定哺乳动物外周循环中的短寿命蛋白，这一效应是通过SPG结构域与一种长寿命蛋白——血清白蛋白的结合来介导的[197]。
最近又建立了一种更为复杂和巧妙的亲和系统[198]。这种多元系统利用了七种不同的亲和标记，从而允许使用多种结合和洗脱条件，为重组蛋白的生产、检测和纯化提供了一个有力的工具。
使用基因融合表达系统在E.coli中表达外源基因已经越来越受欢迎。这在很大程度上归因于融合系统能够产生大量的可溶性的融合蛋白。谷胱甘肽Ｓ－转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）以及硫氧还蛋白（Trx）均已经被证实能非常成功地生产正确折叠、有生物活性的蛋白质，能明显提高在E.coli细胞质中产生的融合蛋白的可溶性，并能抑制包涵体的形成[159，194]。其中每一种都备有方便的纯化方法，可将融合蛋白与细胞污染物分开。已经建立了多种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法，方法的选择通常由特定蛋白的组成、序列及物理性质决定[199]。可采用诸如溴化氰（Met↓）、羟胺（Asn↓Gly）、等试剂或低pH(Asp↓Pro)来进行融合蛋白的化学裂解。化学裂解的方法较便宜而且有效，甚至常常可以在变性的条件下裂解非变性不能溶解的蛋白质。但有时目的蛋白中存在裂解位点，或因发生副反应而导致对蛋白质进行不必要的修饰，从而阻碍了它们的应用。作为一个备选方案，酶解的方法相对来说其反映条件较温和，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特异性。其中常用的酶有：Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶和胶原酶。所有这些酶都具有较长的底物识别序列，从而降低了蛋白质中其他无关部位发生断裂的可能性。在上述提及的各种酶中，Xa因子和肠激酶应用最多，因为它们切割各自的识别序列的羧基端，使带有天然氨基酸的被融合部分得以释放。

分子伴侣
目前已经达成共识，有效的蛋白质翻译后折叠、多肽装配成寡聚体结构以及蛋白质的转位都是由一种被称为分子伴侣的专职蛋白来介导的[200]。原核生物的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶在E.coli中的有效合成和装配需要GroES和GroEL蛋白的证据，使得利用分子伴侣在E.coli中进行基因高效表达成为近来研究的热点[201]。但是，利用分子伴侣所得到的实验结果并不一致，而且迄今为止，伴侣分子的共表达对基因表达的影响似乎都具有蛋白质特异性[202]。目前尚不清楚在基因过度表达的情况下，分子伴侣的体内水平是否受到限制。正常情况下，蛋白质的折叠最终达到一种热力学的稳定状态。特别不稳定的蛋白即使在伴侣分子存在的情况下，或许也不能正确折叠。因此，多肽链的截断、多亚基蛋白复合物单个结构域的产生、缺乏维持蛋白质正常结构的二硫键的形成以及缺乏翻译后的修饰如糖基化等，都将不可能达到热力学的稳定状态。现在已经明白不同类型的伴侣分子正常情况下是协同发挥作用的[203]。因此，只过度表达单一的伴侣分子可能不太有效。在某些情况下，共表达与靶蛋白来源相同的伴侣分子可能是必要的。还有一个需要考虑的变量是培养温度。例如，在30℃时GroES-GroEL共表达能够提高β-半乳糖苷酶的产量，而在37℃或42℃则不能[204]。最后，伴侣分子的共表达有可能导致表型的改变如细菌丝状生长，这有可能对细菌的生存和蛋白质的产生不利[205]。最近有报道表明，将人或鼠的蛋白质二硫键异构酶（PDI）与靶基因共表达，能提高在E.coli细胞质中正确折叠蛋白质的产量[206，207]。E.coli细胞质中二硫键的形成是由维持氧化还原电势的一组蛋白质来促进的[208]。有人认为DsbA（一种可溶性的细胞外周质蛋白）直接催化蛋白质中二硫键的形成，而DsbB（一种内膜蛋白）则参与DsbA的再氧化。真核生物的PDI能够补充dsbA缺失突变株的表型，但其功能在dsbB突变株中完全丧失。另外，通过额外添加谷胱甘肽可以提高PDI增强靶蛋白产生的能力。这些证据表明，PDI有赖于细菌氧还蛋白来完成自身的再氧化[207]。

 
培养条件
     E.coli中的蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统而获得显著提高。高细胞密度培养系统可以分成三类：分批培养、补料分批培养和连续培养。这些方法能获得超过100g/升的细胞浓度，从而获得廉价的重组蛋白。有关大规模培养系统的资料已有详细的综述[193，209]。培养基的组成需要仔细地计算和监控，因为这对细胞和蛋白质的产生具有重要的代谢效应。例如，不同mRNA的翻译可以因温度和培养基的变化而受到不同程度的影响[210]。营养成分和培养参数如pH、温度和其他参数都会影响蛋白酶的活性、分泌和产量[211]。已经证明对培养基的特殊操作能明显提高蛋白质释放到培养基中。例如，在培养基中添加甘氨酸能增强外周质蛋白释放到培养基中，且不引起明显的细菌裂解[212，213]。同样，在山梨糖醇和甘氨酰甜菜碱存在的渗透压力下培养细菌，可以使可溶性的活性蛋白产量提高多达400倍[139]。
高细胞密度培养系统也有其自身的缺陷。这些缺陷包括在高细胞密度情况下，溶解氧的量有限；二氧化碳水平能够降低生长速度、刺激乙酸形成降低发酵罐的混合效率和产热等。有关这些问题的解决方案已经有详细的介绍[193]。利用高细胞密度培养系统生产重组蛋白质的一个主要问题是乙酸的积累，这种亲脂性成分对细胞的生长是有害的[193]。虽然有多种解决这一问题的方案，但是均各有缺点。近来这一问题通过将来自B. subtilis编码醋酸盐合成酶的alsS基因导入E.coli细胞中得以解决[141]。该酶催化丙酮酸转化为非酸性和低毒性的副产品。乙酸积累的减少极大地改善了重组蛋白的产生。另外，其他酶缺陷的E.coli突变株也已经建立，这些突变株产生较少的乙酸，从而提高了人重组蛋白的表达水平[214]。
 
总结
一种高效的原核表达载体需要包括一个强大并且可以严紧调节的启动子；一位于翻译起始密码子5’端大约9bp的SD序列；位于目的基因3’末端的一个高效转录终止子。除此之外，载体还需要一个复制起点，筛选标记和利于对启动子活性进行严紧调节的基因。这种调节元件可以插入载体自身，也可以插入宿主的染色体。其他的元件包括转录和翻译增强子等。这些元件的作用往往具有基因特异性，因此要根据不同的情况加以取舍。我们在综合国内外研究的基础上，对有可能影响E.coli中蛋白质高效表达的多种因素进行了总结。尽管目前在E.coli中表达外源基因方面已经有许多重大进展，但仍有许多问题亟待解决。归纳起来主要有以下几点：
1．  借助于细胞的分子伴侣机制来提高正确折叠的蛋白质的产量。或许可以通过共表达多种分子伴侣编码基因和通过激细胞内众多不同的分子伴侣的方法来实现。
2．在E.coli中表达真核膜蛋白和多亚基蛋白质复合物的难题上有待解决。
3．  蛋白质分泌到培养基中的真正和有效机制需要明了。目前已经有多种体系能够是重组蛋白质分泌到培养基中。其中有些是利用信号肽、融合伴侣和具有穿透能力的因子，这种因子能够引起外膜的破坏和有限的渗漏。而另外的策略是利用已经存在的分泌通道，来保证更高特异性的分泌。有关这方面的工作需要对E.coli中众多分泌通道的更多了解。
4．  赋予原核细胞诸如真核细胞那样进行翻译后修饰的能力。例如糖基化、磷酸化、乙酰化和酰氨化等。可以通过将合适的真核细胞酶类转入E.coli中而达到这些目的。
总之，E.coli作为一种原核表达系统具有多方面的优点，加之在许多技术方面的众多重大进展。E.coli仍然是基础研究和商业生产重组蛋白质的强有力工具。

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