底物浓度对饲用木聚糖酶酶活测定的影响
2010-12-02 09:43:43   来源：本站原创   评论：0 点击：

段永忠 唐湘华 李俊俊 黄遵锡
摘 要 针对运用终点法以DNS还原糖法测定木聚糖酶活力过程中,底物浓度对测定结果的影响进行了试验分析,并结合实际和理论意义进行综合考虑,提出了在测定过程中对试验结果影响较小的适宜底物浓度,提高准确性和可重复性。
关键词 木聚糖酶；底物浓度；酶活测定；DNS法
中图分类号 S816.3
木聚糖酶作为一种新型的酶种，应用于饲料工业和食品工业中，尤其在畜禽饲料中使用效果更为明显，可以降低非淀粉类多糖含量高的日粮在肠道内的粘度，充分释放饲料中的营养成分，激发内源酶的活性，降低饲料成本等方面都有重要作用。
由于日益广泛地应用酶制剂，对酶制剂中酶含量（酶活）的检测就显得非常重要。而影响酶活测定结果的因素又非常多，概括起来可以分为定义因素和非定义因素两大类。一般认为定义因素对测定的结果影响较小，但当使用不同精确度的仪器时，由定义因素引起的误差也不容忽视。非定义因素是指在测定过程中没有明确的量化规定，各实验室甚至每个试验者都采用不同的标准，这些因素往往对测定的结果有较大的影响。非定义因素主要包括测定方法的选择、底物浓度、酶浓度（酶的稀释倍数）、测定反应时间的选择、缓冲液的种类及浓度、激活剂和抑制剂等。由于相关机构还没有对这些影响因素加以统一规范，导致测定的结果各个实验室之间没有可比性，造成交流上的很大障碍。本文以DNS法测定饲用木聚糖酶酶活来研究底物浓度对酶活测定结果的影响。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 酶制剂
昆明爱科特生物技术有限公司生产固体酶制剂。
1.1.2 试验试剂
D(＋)木糖，生化试剂，中国医药(集团)上海化学试剂公司生产;3，5－二硝基水杨酸(DNS),分析纯,中国医药（集团）上海化学试剂公司生产;燕麦木聚糖(xylan from oat spelt),Sigma(x0627)公司产品,其它试剂均为国产分析纯。
1.1.3 试验仪器及设备
722 s可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司生产；天平，Mettler-teledo PL203,分度值0.001 g；pH计，Mettler-teledo Dalt320，精确度：±0.1；普通恒温水浴、艾科纯水仪、冷冻离心机、磁力搅拌器等。
1.2 试验方法
1.2.1 0.1 mol/l柠檬酸-0.2 mol/l磷酸氢二钠缓冲液(pH值5.4)
称取9.297 g一水合柠檬酸和39.923 g十二水合磷酸氢二钠溶于烧杯中,用RO水溶解并定容到1 000 ml,用pH计校正为pH值5.4。
1.2.2 木糖标准溶液(500 μg/ml)
准确称取0.025 g经100 ℃烘干2 h左右的木糖,用适量缓冲液溶解并定容到50 ml,4 ℃冰箱存放备用。
1.2.3  1%(W/V)木聚糖底物溶液
称取木聚糖0.500 g加入10 ml 0.5 mol/l的氢氧化钠溶液于一小烧杯中，并将此小烧杯放入盛有热水的大烧杯中，置于磁力搅拌器上中速搅拌直到木聚糖完全溶解，加入大约300 μl的冰乙酸调节pH值5.4，然后用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容到50 ml，为了使底物更加澄清，可以在3 500 r/min条件下离心10 min，取上清液作为底物溶液。
1.2.4  DNS试剂的配制
将6.3 g 3，5－二硝基水杨酸和262 ml 2 mol/l的氢氧化钠溶液,加入500 ml含有185 g四水酒石酸钾钠的热水溶液中,再加入5 g苯酚和5 g亚硫酸钠,玻璃棒搅拌溶解,冷却后加RO水定容到1 000 ml,储于棕色瓶中并避光室温下放置7 d后,用烧结玻璃滤器过滤,用于制作标准曲线。
1.2.5 标准曲线的制作
取木糖标准溶液0.1～2.0 ml(每0.1 ml为一个梯度),加缓冲液到4.1 ml于具塞刻度玻璃试管中,再加入3 ml DNS试剂,空白为4.1 ml缓冲液中加入3 ml DNS试剂,每一试验取2个平行,加好以后在沸水浴中加热15 min,冷却,用缓冲液稀释到25 ml,在550 nm处以空白调零进行比色,以吸光度的平均值为纵坐标,以木糖的含量(μg)为横坐标制作标准曲线。
1.2.6 待测酶液的制备
准确称取1.000 g供试酶制剂于烧杯中,加入30 ml pH值5.4的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液,磁力搅拌30 min,再用该缓冲液定容到50 ml,取已定容的酶液1 ml置eppendorf管中于4 ℃冷冻离心机10 000 r/min离心5 min,取上清用缓冲液作不同的稀释作为供试样品。
1.2.7 酶活单位的定义及计算公式
在该木聚糖酶的最适反应温度(50 ℃)和最适反应pH值(5.4)条件下,在10 min的反应时间内,以1%(W/V)的燕麦木聚糖为底物,每分钟水解木聚糖底物释放出1 μmol还原糖(以木糖计)所需要的酶量为1个酶活单位,以U表示。
酶活计算公式: X=(W×N)/(V×t×150)。
式中：X——酶活(U/g)；
V——反应中加入酶液的量（ml）；
W——木糖的生成量(μg)；
t——反应时间(min)；
N——酶制剂的稀释倍数(制备成酶液的毫升数/酶制剂的量, ml/g)；
150——木糖的摩尔质量（g/mol）。
1.2.8 底物浓度对酶活测定的影响
分别取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 ml 1％的木聚糖底物加入pH值5.4的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液到4.0 ml,再加入已稀释的待测酶液0.1 ml(稀释倍数为10万倍)作为试验组;空白组为底物溶液中先加入3 ml DNS试剂,再加入pH值5.4的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液到7.0 ml,最后加入0.1 ml酶液,保温10 min,反应完成后在试验组中加入3 ml DNS试剂终止反应,沸水浴中加热15 min,冷却后用缓冲液定容到25 ml,在550 nm处以相应组的空白调零比色,每一不同浓度的底物试验取2个平行,以平均值为测定结果
2 试验结果
2.1 标准曲线
经过对不同用量标准木糖溶液的吸光度与木糖的含量进行拟合,最终确定了R2较大的回归方程:y=0.000 8x-0.045 2,R2=0.999 0,其中y为吸光度；x为木糖的含量（μg）,该回归方程的使用范围为50~750 μg木糖/体系。
2.2 底物浓度对酶活测定结果的影响及分析
各管的吸光度及酶活测定结果如表1。

从表1可以看出，随着底物用量的增加，吸光度也随之增加，酶活的测定值也在增加，但当底物用量为3.0 ml时,再增加底物用量时,酶活的测定值增加趋势变弱,故可以认为3.0 ml的底物用量是一个比较适宜的值。
为了进一步研究底物浓度对酶促反应的影响,需要计算该木聚糖酶的Km值和该酶促反应的Vmax值。以单位时间内单位体积的产物生成量来表示该酶促反应的速度,用V-V/[S]作图法求Km和Vmax值(见表2、图1)。

图1可见,该酶的Km值为2.644 4 mg/ml,该酶促反应的最大反应速度Vmax的值为4.359 8 μg/(ml·min),结合表2可知,当底物用量为3.0 ml(底物浓度为7.32 mg/ml)时,该浓度为Km值的2.8倍,此时的反应速度为最大反应速度的75%。已有的资料表明,用动力学原理测定酶活时,在试验反应系统中使用适当的底物浓度是一个很重要的问题。表3列出了不同的底物浓度与Km值之比条件下运用动力学原理测定酶活时存在的误差。

根据上述资料,底物浓度为Km值的10~100倍时,测定结果的误差相对较小,这是我们选择底物浓度的参考值。但在实际测定中又考虑到底物的价格、溶解性、毒性等因素的影响,还有的酶促反应在高浓度的底物存在时会抑制酶的活性,推荐的底物浓度应不小于5倍的Km值,但在以木聚糖为底物测定木聚糖酶酶活时,达到5倍以上Km值的底物浓度是比较困难的,一方面是由于木聚糖是聚合物,溶解度较低而高浓度时难以配制成溶液；另一方面,高浓度的木聚糖溶液会带来高的本底值,因为木聚糖中有聚合度较低的寡糖可以与DNS试剂反应而显色,又将产生新的误差来源,还有的木聚糖底物中存在有酶的抑制剂,高浓度的底物会使抑制剂的浓度也提高而抑制了酶的活性,故这个值只能作为一个参考值而不应成为普遍适用的标准。本研究的结果表明,木聚糖酶酶活测定中底物浓度选择2～3倍Km值是比较适宜的。
在用动力学原理测定酶活时有一个内在的要求要满足,即要求底物过量的情况下测定酶促反应的初速度。测定初速度一方面可以保证底物过量(一般情况下初速度时间范围内底物的消耗量不超过5%),另一方面可以防止产物对酶的抑制作用以及由于产物浓度的增加导致逆反应加剧等情况的发生。要求底物过量是因为只有在高浓度底物存在的情况下,酶才可以被底物所饱和,这时没有游离的酶分子存在,所有的酶分子都转变为ES复合物,由米氏方程可知,此时的反应速度(V=K[E]，零级反应关系式)与酶量成正比例关系,只有这时我们才可以用反应速度的大小来表征酶量(酶活),而在酶分子不能被底物饱和的情况下,反应速度与酶量之间不存在正比例关系,也就不能用酶促反应的速度来表征酶活的大小了。而表3中所列出的误差正是由于这种原因所产生的。
结合本试验的数据可以计算出不同的底物浓度情况下，酶被底物饱和的情况，见表4。

当底物用量为3.0 ml时,大约有70%的酶分子被底物分子所饱和,再增加底物浓度时,酶分子被底物饱和的百分数增速变缓,故在测定反应中取3.0 ml的底物用量较适宜,从而认为在测定木聚糖酶酶活选用2～3倍Km值的底物浓度是较合理的。
利用米氏方程的积分形式lg[S]=lg[St]-kt/2.3 (k= Vmax/Km)可以反映出随着反应时间的延长,底物浓度降低的情况(见表5)。

由表5可见,随着反应时间的延长,消耗掉的底物浓度增大,而使酶分子被底物分子的饱和状态有所降低,表现出随着反应时间的延长,所测定的酶活值逐渐减小,这实质是由于底物浓度降低所致。该表也从另一方面说明,测定酶活时宜选用30 min的反应时间,这是由于在30 min的反应内底物的消耗量约为4.5%,满足反应初速度的要求(底物的消耗量不超过5%),而又使生成的产物量较大,提高测定反应的精确度。
3 小结
在酶活测定中既要求测定反应的底物过量,又要测定反应的初速度,这些都是非量化的规定,在实际操作中很难掌握,尤其是底物浓度过量的要求,很容易忽略且难以判断。本文运用运动力学原理建立了一种判别依据,以期尽可能地减少试验误差,真实反映酶的性能提供一些参考意义。
（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）
段永忠，云南师范大学生命科学学院，650222，云南省昆明市龙泉路355号云南师范大学新区705信箱。
唐湘华、李俊俊、黄遵锡（通讯作者），单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2008-12-01
★ 云南省产业重大关键技术开发专项项目（项目名称:饲用高效、高产木聚糖酶产业化关键技术的研究）