发酵花生壳粉生产复合酶的初步研究
2011-01-19 18:45:05   来源：本站原创   评论：0 点击：

海 何蔚荭 王红云 陈小鸽 向凌云
摘 要 从实验室保藏的菌株中选取了一株能发酵花生壳粉产酸性蛋白酶的菌株黑曲霉HKS-07，并通过诱变得到高产菌株UV11，对培养基组成及培养条件进行了优化研究试验。结果表明，菌株UV11在m(麸皮)：m（花生壳粉）为6：4、豆粕10%、（NH4）2SO4 2%、MgSO4·7H2O 0.05%、K2HPO4 0.1%的培养基质上，加水比1：1.1，接种量为105~106个/g，置28～30 ℃下培养24～30 h，产酶量为酸性蛋白酶1 226 U/g、纤维素酶7 996 U/g、木聚糖酶3 192 U/g、糖化酶1 080 U/g，热稳定性好，具有良好的应用前景。
关键词 花生壳粉；固态发酵；复合酶
中图分类号 S814
自从1975年美国饲料工业首次把微生物酶作为添加剂应用于配合饲料中，在饲养业取得显著效果后，它已被饲料界广泛接受并在饲料中普遍使用，发展迅速。本研究以农副产品废弃物花生壳粉为原料，添加其它辅料，利用选育的酸性蛋白酶高产菌株UV11固态发酵生产饲用复合酶，并对其发酵工艺条件进行了初步的研究。
1 材料与方法
1.1 原始菌株
黑曲霉HKS-07，由本实验室保藏。
1.2 培养基
1.2.1 察氏培养基
NaNO3 3.0 g、KCl 0.5 g、FeSO4 0.01 g、K2HPO4 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g 、蔗糖20.0 g、琼脂20.0 g、蒸馏水1 000 ml，pH值6.7。
1.2.2 豆汁培养基
5°Be"豆汁1 000 ml、MgSO4·7H2O 0.5 g 、可溶性淀粉2.0 g、KH2PO4 1.0 g、（NH4）2SO4 0.5 g、琼脂20 g, pH值 6.0。
1.2.3 孢子增殖培养基
葡萄糖50 g、蛋白胨0.20 g、（NH4）2HPO4 0.56 g、KH2PO4 0.144 g 、MgSO4·7H2O 0.12 g、琼脂20 g、啤酒45 ml，蒸馏水1 000 ml，pH值自然。
1.2.4 筛选培养基
5Bx麦芽汁培养基加入0.5%干酪素，胆酸钠0.2%，琼脂2%，pH值5.4。
1.2.5 发酵培养基
麸皮60 g、花生壳粉40 g、豆粕10 g、 （NH4）2SO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、K2HPO4 0.1 g，pH值自然。
1.3 菌株的诱变选育
1.3.1 菌株分离诱变程序
出发菌株→制备孢子悬液→紫外线诱变处理→初筛→复筛→发酵性能测定→生产菌株。
1.3.2 诱变选育
将出发菌株培养的成熟菌管，加入无菌蒸馏水，用无菌刮铲轻轻刮下成熟孢子，经过滤、玻璃珠打散，采用血球计数板计数，制成最终浓度为1.0×106个/ml的孢子悬浮液，垂直置于30W紫外灯下方25 cm处，搅拌进行紫外线照射，照射时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 min。照射后立即用黑牛皮纸包扎好，于红灯下稀释涂平板，倒置于30 ℃恒温箱中避光培养3 d，挑取孤立菌落稀释涂抹于筛选培养基平皿上，30 ℃培养3 d后，挑取透明水解圈与菌落比大的单菌落移接于察氏试管斜面培养保藏。
挑取上述诱变株成熟孢子,转接于发酵培养基中，进行固态发酵复筛,0 ℃培养24 h后，测定酶活力。
1.4 分析方法
水分采用QB/T6435饲料水分的测定方法；铅砷采用QB/T13079饲料中卫生指标的测定方法；糖化酶活力的测定采用QB1803A2糖化酶活力的测定方法；酸性蛋白酶活力测定采用QB1804蛋白酶活力的测定方法；纤维素酶活力的测定采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法。
1.5 酶活力测定
1.5.1 酶活力单位定义
1 g固体酶粉(或1 ml酶液),在pH值5.0、50 ℃条件下,每分钟内水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)生成1 μg还原糖所需酶量定义为1个纤维素酶活力单位(U)。
在pH值4.8、50 ℃条件下，1 g固体酶粉每分钟水解木聚糖生成1 μmol木糖的酶量，称为1个木聚糖酶活力单位（U）。
1.5.2 酶液制备
准确称2.00 g酶制剂，加温水100 ml，40 ℃浸泡1 h，以脱脂棉过滤备用。
1.5.3 标准曲线的绘制
分别吸取0.1%标准葡萄糖溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml，分别定容至50 ml。再分别吸取上述溶液各2.5 ml于试管中，各加2.5 ml 3，5-二硝基水杨酸，煮沸5 min（另做一管对照，取2.5 ml 3，5-二硝基水杨酸，同样煮沸5 min）。冷却后，用721型分光光度计在530 nm波长下比色，记录各管的光密度值，以光密度做纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为横坐标，绘制标准曲线。
1.5.4 酶活测定方法
取一支小试管（15 mm×150 mm）,加羧甲基纤维素钠溶液2.0 ml，于50 ℃水浴中预热2～3 min,加稀释酶液0.5 ml,保温30 min,取出加入3,5-二硝基水杨酸2.5 ml,沸水浴煮沸5 min,冷却后用721型分光光度计530 nm处比色测定OD值。另取小试管加羧甲基纤维素钠2.0 ml,先加入2.5 ml 3,5-二硝基水杨酸,再加酶液0.5 ml,其它操作同样品测定，作为空白测定。
1.6 发酵条件
斜面菌种培养是(29+1) ℃，培养3～4 d；扩大种子培养基是(29+1) ℃，培养3～4 d；固体发酵培养是(29+1) ℃，培养24～28 h。
2 结果与分析
2.1 菌株的诱变选育
2.1.1 初筛
将出发菌株黑曲霉HKS-07菌管加入适量无菌蒸馏水，无菌操作刮下成熟孢子，经玻璃珠打散制成均匀悬浮液进行紫外线照射处理，照射时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 min，紫外线照射时间与孢子致死率之间关系见图1。

从图1中可看出，随着紫外线照射时间的延长，孢子致死率逐渐提高，辐射达4 min时孢子致死率为92.3%，选择照射时间为2 min，为最佳的诱变时间，诱变效果最好。从中选择在筛选培养基中透明圈直径大的突变株进行复筛。
2.1.2 复筛
分离筛选培养基平板倒置于30 ℃恒温箱中静止避光培养3 d，选择菌落生长快,透明水解圈大的，且HC值大的菌落30株进行固态发酵试验，从中再选取酸性蛋白酶活力较高的10株菌株进行第二次发酵复筛选，测定酸性蛋白酶活力、纤维素酶活力、木聚糖酶活力及糖化酶活力，500 ml三角瓶固体发酵结果见表1。

从表1可以看出,酸性蛋白酶活力高的菌株,其纤维素酶活力也有较大的提高,提高幅度有所不同,酸性蛋白酶活力提高与纤维素酶提高基本正相关;纤维素酶活力与木聚糖酶活力提高幅度大致呈现正相关,因此可以以此酸性蛋白酶菌株产生酶活力高低作为本试验初筛的依据。
通过固态发酵复筛试验，从中选育出了一株酸性蛋白酶活力与纤维素酶活力均较高的、酶系全的适合幼龄动物应用的复合酶高产菌株UV11。从表1中可观察到UV11菌株固态发酵酸性蛋白酶活力与纤维素酶活力均较高，分别达到1 226、7 996 U/g，明显高于其它菌株，较出发菌株HKS-07分别提高了51.3%、31.0%。同时UV11的木聚糖酶活力为3 192 U/g,糖化酶活力1 080 U/g，也较出发菌株有所提高。将此菌株作为生产菌株作进一步应用研究。
菌株UV11的传代稳定性试验结果见表2。将此菌株UV11在察氏培养基上进行5次传代试验培养,每转接1次,同时进行转接入固态发酵培养基产酶试验，成熟后测定酶活力，观察菌株遗传稳定性。
从表2试验结果看出，菌株UV11遗传稳定性较好，5次传代试验产酶活力保持稳定，生物学性能稳定。

2.2 固态发酵培养基的优化筛选
2.2.1 碳源的选择
分别以麸皮、花生壳粉、玉米秸秆粉作为供试碳源进行应用试验。将原料加入适量水，拌匀，装入盒中，手提式高压蒸汽灭菌锅121 ℃灭菌30 min。出锅后，冷却至30 ℃左右加入曲种，接种比例3‰，放入曲盘中，于恒温箱（29±1） ℃，保温保湿进行培养，培养15~16 h，曲料结块，若品温过高，超过35 ℃，可进行翻曲一次，以供给菌丝生长所需氧气，进行较好的生长，发酵26~28 h，曲料变色发黄，即成熟，取出，50 ℃烘干，测定各项酶活力，找出最佳产酶培养基所需最佳碳源（见表3）。

在发酵试验中,可观察到培养基配比中随着麸皮含量的增加,菌丝生长快且健壮,结块早,而纯玉米秸秆粉结块及菌丝生长情况均最差。由表3可知，以麸皮和花生壳粉为复合碳源培养基的酸性蛋白酶活力和纤维素酶活力较高,其它酶活力相比较也较高。综合考虑,选择麸皮和花生壳粉的复合碳源较佳。
2.2.2 氮源的选择
以复合碳源麸皮和花生壳粉为基本培养基，在其它条件相同的条件下，添加适量的（NH4）2SO4、尿素、NH4Cl、NaNO3、豆粕、蛋白胨为试验氮源，进行固态发酵试验，分别测其各项酶活力，观察它们对产酶的影响，结果见表4。
由表4可以看出,无机氮源中(NH4)2SO4作氮源效果较好,测得酸性蛋白酶活力、纤维素酶活力较高,高于对照组,NaNO3为氮源对木聚糖酶有较好的促进作用,以尿素为氮源的培养基中菌丝不生长，不结块,有较大的尿素挥发气味，分析原因可能是这种尿素的气味抑制了菌丝的生长，该菌不适宜在尿素为氮源的培养基中生长。有机氮源中豆粕、蛋白胨对产酶也有明显的促进作用,酸性蛋白酶活力、纤维素酶活力较高,尤其是酸性蛋白酶活力提高较大,考虑到生产操作及生产成本因素,有机氮源选择豆粕较合适。

2.2.3 金属离子Mg2+、K+、Fe2+对酶活力的影响
以较好碳源麸皮和花生壳粉(麸皮60 g,花生壳粉40 g)为基本培养基,添加10%豆粕、2%(NH4)2SO4,在此基础上,分别添加0.05%的MgSO4、0.1% K2HPO4、0.05% FeSO4进行固态发酵培养试验，测定各项酶活力，观察金属离子Mg2+、K+、Fe2+对酶活力的影响，结果见表5。

从表5可以看出，在以麸皮与花生壳粉为碳源，添加适量豆粕与(NH4)2SO4为氮源，加入一定浓度的MgSO4、K2HPO4、FeSO4发酵，固态发酵酶活力测定结果为：Mg2+对提高各种酶活力有一定的促进作用，K+对木聚糖酶活力有一定促进作用，Fe2+对酶活力提高不起作用。
2.2.4 培养基加水量对产酶的影响
在固态发酵培养基中，加水量过大会造成培养基粘度增加，透气性差，培养基中易造成细菌的污染，加水量过小则不能满足菌株生长对水分的需求。加水量对产酶的影响见表6。由表6可知，加水比例为1：1.1时产各种酶活性较高。

2.3 固态发酵培养条件的优化
2.3.1 菌种接种量对产酶的影响
适当的接种量有利于孢子的萌发，菌丝体的生长，培养基营养物质的合理利用，酶的形成。较低的接种量形成的菌丝体粗壮，由于菌丝体密度不够，不利于高浓度产酶的形成；较高的接种量由于营养物质过度吸收，菌丝体细小，散热慢，不易排出废气，一般产酶能力也较低，只有当接种量合适时，形成的生物量才能达到最大值，产酶活力也最高。经多次试验可得出以下结论，当接种量为105～106 个/g时，菌体产酶活力基本可达到最大值。
2.3.2 培养温度对产酶的影响
微生物的生命活动是由一系列生化反应组成的，而这些反应受温度影响极为明显，温度是微生物生长的重要因素之一。最适生长产酶温度一般为28～30 ℃。当温度超过34～35 ℃时，曲霉生长受到明显的抑制，产酶率下降。温度达到40 ℃，几乎不能生长。我们经过初筛、诱变、复筛优化后的菌株，耐高温性能明显提高，菌株UV11发酵生长可耐受34～35 ℃的培养温度，热稳定性能提高，但超过35 ℃，酶活力均下降。
2.3.3 培养时间对产酶的影响
曲霉生长发酵大致可分两个阶段，前期以孢子萌发、菌丝细胞生长为主；后期以产酶为主。发酵应在产酶活力最高时结束，为发酵成熟标志。菌株UV11在培养基上发酵产酶，其酸性蛋白酶活力、纤维素酶活力的高峰出现时间不同，经多次试验可发现，酸性蛋白酶活力最大值出现在连续培养24 h前后,培养30 h前后出现纤维素酶活力最大值，本研究以取得最大酸性蛋白酶为基准，因此发酵周期时间定为24 h，得到最佳酸性蛋白酶活力。
2.4 复合酶的热稳定性
一般复合酶要经受饲料加工制粒高温处理过程，因此，复合酶具有较好的热稳定性相当重要。复合酶的耐热性能试验是在85 ℃固体干热条件下,分别保温0、15、30、45、60 min，测定其剩余酶活力(见表7)。

试验结果表明，复合酶在85 ℃条件下处理不同时间后，酸性蛋白酶活力、纤维素酶活力、糖化酶活力仍保持较高的酶活力，酸性蛋白酶保持90.5%的相对酶活力，纤维素酶活力保持92.7%的相对酶活力，木聚糖酶活力保持91.5%的相对酶活力。总体来讲，该复合酶能够满足耐受饲料高温短时间制粒要求，热稳定较好。
3 小结
3.1 从保藏的一株酸性蛋白酶菌种出发，诱变选育出了一株产酸性蛋白酶高的菌株，且其纤维素酶活力也有较大的提高。菌株具有遗传稳定性，可发酵花生壳粉生产饲用复合酶。
3.2 通过试验可发现，菌株UV11在m(麸皮)：m(花生壳粉)为6：4、豆粕10%、(NH4)2SO4 2%、MgSO4·7H2O 0.05%、K2HPO4 0.1%的培养基质上，加水比1：1.1，接种量为105～106 个/g，置28～30 ℃下培养24 h，产酶量为酸性蛋白酶1 226 U/g、纤维素酶7 996 U/g、木聚糖酶3 192 U/g、糖化酶1 080 U/g,具有热稳定性。
参考文献
[1] 王世英，雷白时，袁洪水，等.饲用复合酶生产菌株的诱变选育[J].河北大学学报.2006，26（1）：81-85.
[2] 周德庆.微生物学教程[M].高等教育出版社，1999.
[3] 刘德海，杨玉华，陈小鸽，等.纤维素酶酶活的测定方法[J].中国饲料，2002（17）：27-28.
[4] 戚炯炯，张嘉，单丽君，等.以柑橘皮为原料用宇佐美曲霉生产饲用复合酶的研究[J].饲料工业.2006，27（16）：11-14.

（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）

刘德海，河南省科学院生物研究所，研究员，450008，郑州市花园路28号。
何蔚荭、王红云、向凌云，单位及通讯地址同第一作者。
陈小鸽，河南省饲料产品监督检测站。