饲料用酶制剂中木聚糖酶酶学性质的研究
2007-06-05 14:08:20   来源：饲料研究   评论：0 点击：

目前国内外关于木聚糖酶的生产条件及其生产菌株的特性报道较多。为了掌握常用饲用酶制剂中木聚糖酶的酶学性质，我们对某商品复合酶制剂中所含的木聚糖酶进行了热稳定性、最适pH值、最适反应温度、底物针对性、不同金属离子对其酶活的影响、反应进程曲线及其酶反应的未氏常数Km值等的测定，以期对常用的木聚糖酶的酶活测定、保存及应用有一定的指导意义。

1  材料与方法

1．l  实验仪器

    精密pH计：±0.01pH；电子天平：d＝1mg；紫外分光光度计UV－1601；恒温水浴锅；蠕动泵；紫外检测器；分布收集器；ф2．6 cm×100 m色谱柱。

1．2  实验材料     某商品酶制剂

1．3  酶活测定

    酶活力测定：采用DNS法

    酶活单位定义：在50℃、PH值为5．0条件下，每分钟产生 1μmol还原糖所需酶量定义为1个酶活单位。

    测定底物：1.0％桦木木聚糖（SigmaX-0502）；

    酶液制备：准确称取1.000g该酶制剂，用0.2mol／L的醋酸－醋酸钠缓冲液（pH值为5．0）定容至500mL，摇匀，静署提取，过滤后取滤液并稀释至适当倍数备用。

    标准曲线：分别吸取1．0mg／mL的木糖标准液0、0.2、0．3、0．4、0．5、0.6、0．7、0．8和1．0mL，依次加入试管中，以蒸馏水补加到2．0 mL。加DNS试剂3mL，于沸水中沸腾7min（样品放人重新沸腾时算起），取出后冷却，加入蒸馏水10mL混匀，于550nm处进行比色测定，用空白管调零点，记录光密度值，以木糖mg数为纵坐标，光密值为横坐标绘制出标准曲线。

    酶活测定：取25mL具塞试管，加入1．0mL木聚糖底物，于50℃保温5min，然后精确加入1．0mL酶液，准确反应30min后测定酶活，空白管先加1mL酶液和3mL DNS试剂，沸水浴3 min，再加lmL木聚糖底物摇匀后沸水浴显色7 min，其余同前。

1．4  实验试剂  

   0．2mol／L醋酸－醋酸钠缓冲液（pH值为5．0）、DNS试剂、10mg／mL木聚糖溶液。

2 实验设计

2.1 木聚糖酶热稳定性研究

2.1.l 干热处理对木聚糖酶活的影响

    在65、75、85和95℃恒温干燥箱中将样品处理10min，立即提取，测定酶活，并以未经干热处理的样品中的酶活为100，干热处理后的酶活为处理前酶活的百分数，即为该酶经干热处理后的剩余酶活。

2．1．2  湿热处理时间对酶活的影响

    准确称取1．000 g样品加入10％的水（加水后总含水量约17％），充分搅拌后盖严，于85℃恒温干燥箱中处理25、5．0、7．5和10min，立即提取并测定其酶活，以未经湿热处理的酶活为100，湿热处理后的酶活为处理前酶活的百分数，即为该酶经湿热处理后的剩余酶活。

2．2  木聚糖酶最适pH值的研究

    用0．1M柠檬酸和0．2 M磷酸氢二钠溶液配制pH值范围为3～7的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，在不同的反应pH值条件下测定其酶活，以酶样最大吸光度的酶活为100。在其他条件下的酶活为最大吸光度酶活的百分数即为该酶在此pH值条件的相对酶活。

2．3  木聚糖酶最适反应温度的研究

      在最适pH值条件下，分别设置不同的反应温度，并测定该条件下的木聚糖酶活，以酶样最大吸光度的酶活为100，在其它温度下的酶活为最大酶活的百分数即为该酶在其它温度下的相对酶活。

2．4  木聚糖酶底物针对性实验

    在最适pH值及最适温度条件下，分别以1．0％桦木木聚糖和1．0％燕麦木聚糖作为底物，测定在不同底物下的酶活。并以桦木木聚糖为底物时的酶活为100，燕麦作为底物时的酶活为桦木木聚糖作为底物时酶活的百分数，即为其相对酶活。

2．5  不同金属离子对木聚糖酶酶活的影响

    用pH值为5．0的醋酸－醋酸钠缓冲液配制的10mg／mL木聚糖（SingmaX－0502）溶液中分别加入不同化合物，并使各离子终浓度为5mmol／L。以不加任何离子的木聚糖液作为底物时所测出的酶活值规定为100％，其它底物条件下所测出的酶活力为其百分数，即可得到该酶在其它条件下的相对酶活。

2.6 木聚糖酶反应进程曲线的测定

    将木聚糖粗酶液用30％（NH₄）₂SO₄沉淀，离心15min去沉淀，取上清液；上清液再用60％（NH₄）₂SO₄沉淀，离心后将沉淀溶解于0．2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH值为5．0）中，上Sephades-G100色谱柱进行分离纯化，用相同的缓冲液洗脱，收集含水聚糖酶的组分，冻干得纯酶。用纯化得到的酶进行如下的反应进程及Km值测定：

    按照反应时间20、40、60、70、80、90、100min进行分组，每组分别添加0．2、0．4、0.6、0．8和1．0mL经过适当稀释的木聚糖酶，不足部分用醋酸-醋酸钠缓冲液（pH值为5．0）补足至最终体积为l mL，按体积比1∶l加入1．0％的木聚糖。50℃水浴条件下按相应的反应时间进行反应，以相对应的先灭活酶液加3mL DNS和1mL 10mg／mL的木聚糖作对照，完毕后在550 nm处进行测定。以反应时间（min）为横轴，反应量(μmol)为纵轴，可给出不同酶添加量时的反应进程曲线。

2.7 木聚糖酶Km值的测定                                                   取8支试管依次编号，在每管中加入不同体积的1％木聚糖溶液，不足部分用0．2 mol／L醋酸－醋酸钠缓冲液（pH值为5．0）补足，使底物体积为1mL，置于50℃预热；向每管中准确加入适当稀释的1mL木聚糖酶液，精确反应30min后进行酶活测定。然后以1／[S]为横坐标，1／v为纵坐标作图，得出Km值。

3  实验结果                                                        3．l  木聚糖酶的热稳定性研究                                       3．1．l  干热处理对木聚糖酶活的影响

 经过不同温度条件下的干热处理对木聚糖酶活的影响实验，得到实验结果如下：                                                                                                          

表1  干热处理对木聚糖酶活的影响

    从实验结果可以看出，该木聚糖酶对于处理温度不超过85℃时其耐干热处理的能力较强。

3.l.2 湿热处理时间对酶活的影响

表2  湿热处理时间对酶活的影响

  在85℃下采用不同时间进行湿热处理得到结果如表2所示。

    可以看出，湿热处理对酶活的影响同干热处理相比要大得多，这是由于在湿热处理条件下，更易使蛋白质变性。

3．2  木聚糖酶最适pH值的研究                                            可以发现，该木聚糖酶在pH值为5．00的条件下，酶活力最高，因此，可以确定该木聚糖酶的酶活测定的最适pH值为5．00。                                     3．3  木聚糖酶最适反应温度的研究                                        从实验结果中可以发现，反应温度对该木聚糖酶酶活的测定影响很大，在50℃时的相对酶活为100％，而在60℃时其相对酶活却仅为50℃时的23.35％。所以，我们选择木聚糖酶的最适反应温度为50℃。                                        3．4  木聚糖酶底物针对性实验                                                 木聚糖酶是一种复合酶，含有多种酶蛋白组分，从已有的研究结果可以发现，能产生水聚精酶的微生物至少有20种，而且不同的微生物产生的木聚糖酶通常也是不同的，另外底物中作用成份含量及分子结构的不同，也必定会造成酶活测定的不一致。陆文清等人进行过底物对酶活测定的影响实验，他们选用燕麦木聚糖和桦木木聚糖作为底物，发现底物不同时测得木聚糖酶活相差很大。为此，我们进行了该木聚糖酶针对不同底物进行了酶活测定实验，结果如表3所示。

表3  不同底物对木聚糖酶活测定的影响

    实验结果资明：该本聚糖酶对于桦木木聚糖的针对性比燕麦木聚糖好。

3．5  不同金属离子对木聚糖酶酶活的影响

表4    不同离子或化合物对木聚糖酶活性的影响

    可以看出， Mg²⁺、 Cu²⁺、Mn^2＋、Zn^2＋、Fe^3＋对于木聚糖酶的活性有抑制作用，其中Cu^2＋的抑制作用最强，酶活损失近70％，其次为Mn^2＋、Fe^3＋、Mg^2＋、Zn^2＋，酶活损失约21．l％～38．8％，Fe²⁺对木聚糖酶活影响不大；此外，Na⁺、K⁺及（NH₄）₂SO₄对酶活性有一定的激活作用。

3．6  木聚糖酶反应进程曲线的测定

      从图3木聚糖酶的反应进程曲线中可以看出，该水聚糖酶液添加量为0．2～1.0mL、时间为60min之内，反应进程曲线均呈线性，所以在这个范围内进行测定，求出的反应速度为最大反应初速度，这有利于酶活的正确测定。               同样地，以酶液添加量为横坐标，反应速度为纵坐标，可以作图得到木聚糖酶的酶浓度曲线如下：                                                      由图4可以发现，该水聚糖酶在反应时间为60min范围之内时，线性关系良好，而在测定时间超过60min后，反应速度开始下降，因此，此浓度曲线从另一个方面也验证了上面的反应进程曲线。

3.7  木聚糖酶Km值的测定                                            米用Lineweaver-Burk法作图如下：                                      将直线延伸，可求得水聚糖酶的Km＝4.485（mg／mL）。                        4   讨论                                                                  本文研究的该木聚糖酶最适pH值和最适温度与其他报道的木聚糖酶相近似，且耐热性能较好。经模拟制粒过程后（85℃、17％水分、处理2．5 min），仍保持较高的酶活（83．10%）。另外，Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和Fe³⁺对本木聚糖酶有抑制作用；而Na⁺、K⁺及（NH₄）₂SO₄对其酶活有一定的激活作用。

    测得该本聚糖酶的Km值为4.485mg／mL，与其他来源的木聚糖酶相比，Km值较低，这说明，该木聚搪酶对木聚糖的亲和性较高。