实验设计法优化核酸酶 Ｐ１的发酵培养基
2006-09-17 17:11:16   来源：不详   评论：0 点击：

１　　前　言　
     核酸酶 P1(EC3.1.30.1)是一种含锌金属酶，分子量 44 000，可以水解 DNA和 RNA的 3′, 5′-磷酸二酯键而得到 5′-脱氧核苷酸和 5′-核苷酸[1-3]. 此酶是 1957 年由日本化学家 Kuninaka 等[4]于桔青霉的培养液中首先发现的，而后因其在大规模生产核苷酸工业上的重要用途而受到广泛关注.
     有文献[5]报道，在液体深层发酵中，添加玉米浆作为蛋白胨的补充氮源可以提高核酸酶 P1的产酶水平，用含有玉米浆的复合氮源进行核酸酶 P1发酵，可以将产酶水平从以前的300 U/ml 提高到 400 U/ml 左右. 本文运用实验设计法(Experimental Design)在原有的培养基配方的基础上，对有较大影响的碳源、氮源、磷源进行优化以最大限度地提高核酸酶 P1的发酵水平.
２　　材料与方法　
２．１　菌种　
     桔青霉 M02(Penicillium citrinum)，本实验室保藏.
２．２　主要药品及仪器　
     酵母 RNA，本实验室提纯精制，纯度高于 95%.
     UV-VIS 8500 型紫外可见分光光度计，上海天美科学仪器有限责任公司；HYG-IIa 回转式恒
温调速摇瓶柜，上海欣蕊自动化设备有限公司.
２．３　培养基　
     斜面培养基：麦芽汁培养基；液体种子培养基(g/L)：葡萄糖 50，蛋白胨 5，KH2PO4 0.5，
K2HPO4-3H2O 0.5, MgSO4 0.4, CaCl2 0.4, pH 6.50；初始发酵培养基(g/L)：液体种子培养基+
ZnSO4-7H2O 0.4, pH 6.50.
２．４　培养方法　
     液体种子液培养：500 ml 三角瓶装100 ml 培养基，接入1 cm2大小的桔青霉菌块，于250 r/min
及 29～30℃温度下培养 24 h. 核酸酶 P1的发酵：250 ml 三角瓶装 50 ml 培养基，按10%(-)的接种
量接种，于 28℃温度下 250 r/min 培养至适合时间.
２．５　分析方法　
     酶活力测定方法：紫外法[6,7]，将 1.9 ml 的底物溶液(含有浓度为 1%左右的 RNA, 0.2 mol/L pH5.2 的醋酸缓冲液及 0.0005 mol/L 的 ZnSO4)于 70℃恒温水浴 10 min 后，加入 0.1 ml 经适当稀释的酶液，70℃保温 15 min后加入 2.0 ml 核酸沉淀剂(0.25%钼酸铵-2.5%过氯酸)，冰水浴20 min 后离心，取上清液用蒸馏水稀释一定倍数，测定其在260 nm 处的吸光值 A260. 以先加沉淀剂者作为
对照，其它操作同前. 在上述条件下，每分钟所生成的核苷酸量在260 nm 处的吸光值的差值为1.0
时定义为 1 个酶活力单位，其计算公式如下：

        酶活力(U/ml)=     (4αβ-A260)/ (0.1×15) = 2.67αβ-A260,     (1) 
       其中α为原酶液的稀释倍数，β为离心清夜的稀释倍数.
     生长量测定方法：干重法[8].
２．６　实验设计及结果分析
     用 Statistica 6.0(StatSoft Inc., Tulsa, OK)软件 Experimental Design 进行实验设计与结果分析[9].
３　　结果与讨论　
３．１　核酸梅 Ｐ１的发酵过程曲线　
      在初始发酵培养基的条件下，研究了核酸酶 P1的发酵，过程曲线见图 1. 由图可知，菌体的生物量在接种后 4 h 左右进入指数生长期，到 25 h 后生长速率则逐渐降低；pH 值起初随着菌体的生长而迅速降低，但在 25 h后则趋于平稳；核酸酶 P1的产量在 8 h 左右进入快速增长期，在25 h 左右其产量达到最大，约为 380 U/ml，而后则逐渐降低. 为此下面的 SEM 优化实验的产酶发酵的取样时间均为 25 h.

        
３．２　实验设计法优化核酸酶 Ｐ１的发酵培养基　
3.2.1 碳源、玉米浆等对核酸酶 P1发酵的影响
     据文献[5]报道，添加玉米浆作为蛋白胨的补充氮源可以提高核酸酶 P1 的发酵水平，为了考察玉米浆对产酶的促进效应，本文在原有的氮源基础上添加了一定量的玉米浆作为蛋白胨的补充氮源，其它营养物质同初始发酵培养基，并对碳源量(X1, 葡萄糖)、氮源量(X2, 蛋白胨或蛋白胨+玉米浆)、玉米浆与蛋白胨的质量比X3以及磷源量(X4, 两种磷酸盐)进行四因素两水平的全因子实验设计，其设计及实验结果分析见表 1. 表中增加了 2 个中心点是为了估计实验误差和考察模型的准确程度，表中的最后一行为方差项.
     由表 1 可知，几个因素对核酸酶 P1 发酵的影响能力次序为：X3>X2>X1>X4，并且可以确定添加玉米浆的复合氮源有利于核酸酶P1的发酵. 几个因素对发酵的影响用STATISTICA 6.0软件进行分析，用此 18 个数据(包括 2 个中心点)回归的模型为
                             Y1=445.3-10.28X1-17.18X2+64.94X3+4.22X4-7.78X1X2-0.51X1X3+7.42X1X4-1.18X2X3-1.01X2X4+0.34X3X4.                                            (2)
     此方程对实验数据拟合的 R2值为 0.976，并由方差分析可知该方程较好地反映了在本文的实验条件下的几种因素对核酸酶 P1发酵的影响. 对此方程进行响应面分析可知，在本次实验的因素水平下，核酸酶P1的产量随着碳源和氮源量的增加而减少，随着磷源量以及玉米浆与蛋白胨比值的增大而增高. 但是几个因素对酶活力的影响大小各异，其中磷源的影响最小，为此进行下一轮的中心复合设计(Central Composite Design, CCD)时，只考虑碳源和氮源量以及两种氮源的质量比 3种因素对发酵产酶的影响.
3.2.2 中心复合实验设计(CCD)优化培养基的组成
     根据上一轮的实验及统计分析结果，适当降低碳源(X1)和氮源(X2)的水平，适当提高复合氮源中玉米浆的比率即降低X3′(蛋白胨和玉米浆的质量比)的值，进行新一轮的实验设计即 CCD(CentralComposite Design)设计. 因为在四个因素中磷源对产酶的影响最小，所以磷源浓度固定为有利于产酶的 0.6 g/L，其它条件同前进行实验设计，其设计及实验结果见表 2.
     对表 2 的实验数据用 STATISTICA6.0 软件进行分析可以得到如下回归方程：
                              Y2=634.1-0.37X1-55.33X1 2 +51.03X2-48.97X2 2-16.46X3′-
17.19X3′2-12.01X1X2+4.88X1X3-21.39X2X3.                                      (3)
     该方程的 R2为 0.962, F=17.245，p<0.00125，因此认为该方程可以较准确地反映这几个因素对核酸酶P1的发酵的影响. 对此回归模型进行响应面分析，可以得到X1, X2, X3′的最佳值为38.73, 3.75,1.04. 因此，可以计算出最优的碳、氮源组成(g/L)：葡萄糖 38.73，蛋白胨 1.91，玉米浆 1.84，此时的核酸酶 P1的产酶水平最高，模型预测值可以达到 661.1 U/ml.
     因此可以得到核酸酶 P1 发酵的优化后的培养基组成为(g/L)：葡萄糖 38.73，蛋白胨 1.91，玉米浆 1.84, KH2PO4 0.6, K2HPO4-3H2O 0.6,MgSO4 0.4, CaCl2 0.4, ZnSO4-7H2O 0.4.

      用此培养基配方进行实验，24 h 时的产酶水平为 648.3 U/ml，与理论值较为接近，说明此优化手段可信度较高，其发酵过程曲线见图 2.   由图 2 和 1 可知，优化后的培养基产酶速度较优化前加快了许多，但是菌体的生物量却略有下降. 这说明添加玉米浆虽然有利于 P1 酶的发酵，却不利于菌体的生长.
４　　玉米浆促进核酸酶Ｐ１发酵机理的初步探讨　
     玉米浆和蛋白胨等都是营养成份比较复杂的有机氮源，它们都含有丰富的蛋白质及氨基酸等营养物质，其中蛋白胨的氨基酸含量高于玉米浆，且它们的氨基酸的组成也差别很大. 蛋白胨中含有较多的谷氨酸、精氨酸等氨基酸，而小分子量的氨基酸，如丙氨酸和甘氨酸含量较低. 而玉米浆中则是丙氨酸、甘氨酸等小分子量的氨基酸占有很大的比例[10,11]. 为此，本文研究了数种不同氨基酸对于核酸酶 P1发酵的影响，其添加量为每 50 ml 培养基加入 1 mg 氨基酸，结果见表 3. 由表可知，除了丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、天冬氨酸以及天冬酰氨外，绝大多数的氨基酸对于核酸酶 P1的发酵都有一定的抑制作用. 而在玉米浆和蛋白胨两种有机氮源中，玉米浆含有较多的可以促进P1 酶发酵的甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸等小分子量的氨基酸，而蛋白胨中含量较大的谷氨酸和精氨酸等都对 P1 酶的发酵有较强的抑制作用. 因而采用玉米浆作为蛋白胨的补充氮源时可以明显促进核酸酶 P1的发酵. 关于这些氨基酸对核酸酶 P1发酵的调控机理有待进一步的深入研究.

    
５　　结　论　
       (1) 含有玉米浆的复合氮源可明显地提高核酸酶 P1 的产量，原因是玉米浆中含有较多的可以促进 P1 酶发酵的氨基酸，如丙氨酸，甘氨酸等. 与之相反，蛋白胨含有较多的谷氨酸和精氨酸等对 P1酶发酵有抑制作用的氨基酸.
       (2) 实验设计法优化后的桔青霉产核酸酶 P1的培养基组成为(g/L)：葡萄糖 38.73，蛋白胨 1.91，玉米浆1.84, KH2PO4 0.6, K2HPO4-3H2O 0.6, MgSO4 0.4, CaCl2 0.4, ZnSO4-7H2O 0.4, pH 6.50. 用该培养基发酵核酸酶 P1，可以将酶活力从优化前的 380 U/ml 提高到 648 U/ml，提高了约 70%.