流式细胞术检测毕赤酵母发酵过程中胞内活性氧水平
2006-09-17 17:22:34   来源：不详   评论：0 点击：

　　活性氧(ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ,ROS)是指氧的某些衍生物如超氧负离子(O-2)、羟自由基(OH·)和过氧化氢(H2O2)等,过量的ROS能够使生物大分子如DNA、蛋白质、脂类发生过氧化链式反应,造成细胞结构的损伤,影响生理活性[1,2]。检测细胞内活性氧的方法很多,有分光光度计法、化学发光法、激光扫描共聚焦显微镜法和电子自旋共振法等。流式细胞技术(Fｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ,FCM)能够快速地对个体细胞进行光化学分析,使研究人员建立个体细胞在群体中的多维表象,与常规的细胞计数方法相比具有很多优势[3],如精确度高,重复性好等优点。
     流式细胞术可以检测细胞的多种生理生化指标,如细胞周期[4]、细胞凋亡[5]、细胞活性[6]、抗原特性[7]等。人们最早从动物细胞开始利用流式细胞术检测胞内ROS。Rｏｔｈｅ等1990年利用流式细胞术检测了噬细胞的呼吸活性[8],Lｕｏ等建立了一种检测受损脊髓神经细胞ROS水平的新方法[9]。微生物细胞胞内ROS的流式细胞术检测的报道不多,Hｏｗｌｅｔｔ检测了铜离子所引起的酿酒酵母胞内ROS的变化,发现ROS水平对细胞周期有一定影响[10]。
     基因工程巴斯德毕赤酵母在分泌表达外源蛋白已经得到了广泛的应用,它容易培养,可以进行高密度发酵培养,外源蛋白表达量高,分泌蛋白易于纯化,是最有前景的商业蛋白质生产工具之一[11,12]。在毕赤酵母发酵过程中,甲醇氧化产生代谢副产物过氧化氢,过氧化氢积累可能会对细胞产生氧化性损伤,并可能影响酵母细胞的生长并且引起外源蛋白的降解,但目前国内外对这个问题并没有确凿的实验数据证明。利用流式细胞术对毕赤酵母代谢甲醇所产生的过氧化氢等ROS产物的检测目前在国内外也未见文献报道,本文首次通过以2′,7′＿二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH＿DA)和碘化丙锭(PI)为探针,建立流式细胞术检测细胞内ROS的方法并对发酵过程胞内ROS含量变化对细胞的定量影响加以分析。
1　材料与方法
1.1　菌株
      Mｕｔ+型毕赤酵母基因工程菌由山东东阿阿胶股份有限公司提供。
1.2　细胞培养
    种子培养:2L三角瓶中装入500ｍL种子培养基(无氨基酸酵母氮源YNB1.34ｇ/L,甘油15ｍL/L,生物素0.4ｍｇ/L),0 1MPａ湿热灭菌30min,接入单菌落,30℃、200r/min培养至OD600为6.0。
     5L罐发酵:发酵罐内装入3L发酵培养基(85%H3PO42 1.36ｍL/L,KOH4 13g/L,CａSO 40.82g/L,MｇSO4·7H2O 14.90g/L,甘油40g/L,ANTIFOAM204(Sｉｇｍａ)0.33ｍL/L),1×105Pａ湿热灭菌30min,再加入4.4ｍL/L微量元素溶液PTM,1∶10接种,28℃,溶解氧>40%培养22ｈ以补料培养基(50%甘油,1×105Pａ湿热灭菌30min,再加入4.4ｍL/LPTM)限制性补料至菌体湿重200g/L,然后以甲醇为唯一碳源限制性流加[13]。
1.3　荧光试剂
     碘化丙锭(PI,Sｉｇｍａ)溶液:1ｍｇPI溶于1ｍL去离子水中,4℃避光保存。2′,7′＿二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH＿DA,Sｉｇｍａ)溶液:0.02ｍｍｏｌDCFH＿DA溶于1ｍLDMSO中,-20℃避光保存。
1.4　FCM检测
     DCFH＿DA/PI双染色:用PBS溶液将发酵样品稀释为1×107ｃｅｌｌｓ ｍL的细胞悬液,吸取1ｍL,加入5μLDCFH＿DA溶液,37℃、50r/min避光负载30min,然后将溶液置于冰上避光保藏。检测前加入5μLPI溶液,然后于流式细胞仪(FACSCａｌｉｂｕｒ,美国BD公司)上检测,激发光波长488ｎｍ,每个样品收集1×104个细胞,CｅｌｌQｕｅｓｔ软件分析结果。PI单染色:另取1ｍL上述细胞悬液,加入5μLPI溶液,流式细胞仪检测,每个样品收集1×104个细胞,作为双染色的阴性对照。
2　结果与讨论
2.1　ROS的FCM
     图谱DCFH＿DA可以通过细胞膜进入细胞内,在胞内非特异性脂酶的催化下,变成2′,7′＿二氢二氯荧光黄(DCFH),DCFH不能发出荧光。当细胞内有ROS存在时,DCFH可以被氧化成2′,7′＿二氯荧光黄(DCF),在激光激发下发出绿色荧光,波长在660ｎｍ左右。    
    当酵母的细胞膜不完整时,PI可以进入细胞,与DNA结合,发出波长530ｎｍ左右的红色荧光,而PI不能进入具有完整细胞膜的活细胞,因此可以通过PI染色检验毕赤酵母发酵过程的细胞活性。当PI染色为阳性(PI+)时为死亡细胞,而PI染色为阴性(PI-)时为活细胞。
      取诱导60ｈ后的发酵液,稀释到所需浓度后,分成A、B、C三份,A中只加入PI进行单染色,B加入PI和DCFH＿DA两种试剂,进行双染色,C在B的基础上还加入5g/L的甲醇,然后分别对A、B、C进行FCM检测,得到以下结果(图1)。DCF发出绿色荧光,强度对应胞内ROS含量,以FL1＿H1表示,PI发出红色荧光,强度以FL3＿H表示。

      根据图1的结果,设定特定的“十字门”将双染色图谱分为四个区:左下区域为双阴性区(DCF- PI-),对应于无(或低)ROS积累活细胞;右下区为DCF阴性PI阳性区(DCF- PI+),为无(或低)ROS积累的死亡细胞;左上为DCF阳性PI阴性区(DCF+ PI-)高ROS积累活细胞;右上为双阳性区(DCF+ PI+),为高ROS积累死亡细胞。
      图1A为只加PI的阴性对照,通过“门”的设立,可以将细胞分为两部分,其中PI染色阳性的为死亡细胞,而没有被PI染色的为活细胞。在毕赤酵母的发酵过程中,甲醇氧化产生代谢副产物过氧化氢,而过氧化氢又被细胞自身产生的过氧化氢酶除去,加入荧光染料DCFH＿DA,就可以检测到胞内ROS的残留量。图1B为DCFH＿DA PI双染色的图谱,与图1A相比,某些细胞已被DCF染色,显示出较强的荧光强度,细胞内部有过量ROS存在,这说明甲醇代谢所产生的过氧化氢等ROS副产物并不能完全被除去。由于发酵过程中甲醇不断地补加,酵母连续地消耗甲醇,过氧化氢不断地产生,考虑到培养基中总是有甲醇存在这种情况,在DCFH＿DA PI双染色过程中添加5g/L甲醇,得到如图1C的图谱。图1C中几乎所有的细胞在纵坐标的荧光强度值都很高,即处于ROS过量的情况。
     图1A、B、C比较可知,毕赤酵母自身的过氧化氢酶具有除去ROS的能力,但并不能即时除去,细胞内仍然有大量ROS存在。
2.2　甘油补料期ROS含量
     在甘油补料期(20ｈ),DCFH＿DA PI双染色的FCM图谱(图2B)与PI单染色的FCM图谱(图2A)几乎完全相同。当DCFH＿DA进入细胞后,生成DCFH,由于甘油的氧化途径不产生ROS副产物,酵母细胞内几乎没有ROS存在,因此DCFH不能转化为DCF,也就不会发出荧光,FCM图谱上细胞显示为DCF- PI-。对图2A进行设“门”分析,此时期的细胞活性接近100%。

2.3　甲醇诱导期FCM图谱
     当发酵进行至29ｈ后,更换碳源,使用甲醇诱导,酵母产生催化甲醇的氧化酶,利用甲醇获得能量用于生长与蛋白表达,同时,也不断产生代谢副产物H2O2。
     甲醇诱导初期(37ｈ)的FCM图谱如图3所示。DCF的荧光强度要高于20ｈ的荧光强度,这说明ROS已经开始在细胞中产生积累。由于这时甲醇的消耗速率较低,ROS的积累量不高,细胞仍能够承受这种压力,大部分细胞仍处于PI-状态,保持较高的活性,死细胞所占比例只有1.5%。

     经过一段时间的适应后,酵母利用甲醇的速度加快,产生的过氧化氢也相应增加。在甲醇诱导后期(88ｈ),如图4,细胞基本上分为DCF+ PI-和DCF+ PI+两个部分,这两部分总计为94.0%,即94.0%的细胞都显示出高水平的ROS积累,其它低水平的ROS积累两部分的细胞很少。

      同时从图中也可看出,过量的ROS使细胞所承受的氧化压力大大高于甲醇诱导初期,造成细胞结构损伤,引起细胞活性的丧失,图中只有68.6%的细胞为高ROS积累的活细胞,而25.4%细胞为高ROS积累的死亡细胞,还有3.7%细胞为低ROS积累的死亡细胞,死细胞总比例为29.1%,远高于甲醇诱导初期(如图3)的1.5%。
3　结论
      本文以DCFH＿DA和PI两种试剂对酵母进行染色,通过对荧光强度信号的分析,可以检测毕赤酵母胞内ROS水平,并首次定量分析了ROS积累对毕赤酵母细胞活性的影响。实验证明,不同发酵时期胞内ROS水平不一,对细胞膜的损伤程度不一。甘油补料期检测不到ROS的积累,细胞活性高。在甲醇诱导初期,有少量的ROS积累,细胞仍能维持完整的膜结构,保持较高的活性。在甲醇诱导后期,94.0%的细胞内积累了大量的ROS,25.4%的细胞已经死亡。