发酵法生产多不饱和脂肪酸的研究进展
2007-10-15 23:31:37   来源：武　汉　工　业　学　院　学　报   评论：0 点击：

0　引言
不饱和脂肪酸( Polyunsaturated fatty acid,PUFAs,下同)指一系列含有两个或两个以上非共轭顺式双键的C18-22的多不饱和脂肪酸,包括n-3和n-6两大类。n-3脂肪酸有:α-亚麻酸(α-linolenicacid, ALA)、二十二碳六烯酸( docosahexanenoicacid,DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)。n-6脂肪酸有:亚油酸( linoleic acid, LA)、γ-亚麻酸(γ-linolenic acid, GLA)、二高-γ-亚麻酸(dihono-γ-linolenic acid, DHGLA)和花生四烯酸(arachidonic acid,AA)。PUFAs通常存在于深海鱼油和某些动植物中,由于气候、产地等条件的影响,含量不稳定,不能满足现在生活中人们的需求。而微生物发酵法生产多价不饱和脂肪酸却不受原料、气候、产地的限制,易规模化、业化生产等优点,因此有着广阔的市场前景。多不饱和脂肪酸具有多种生理功能,目前研究表明主要有以下功能。①PUFAs在细胞膜中的作用。PUFAs是生物膜的重要组成成分,可以调节细胞构型、动态平衡、相转变及细胞膜的渗透性,同时还可以调节与膜有关的生理过程,如脂代谢、细胞识别、免疫反应和寒冷的适应性等。②PUFAs在基因表达中的作用。PUFAs具有调节某些基因表达的作用,如调节编码脂肪酸合成酶、钠离子通道蛋白、氧化氮合成酶、7-α-胆固醇脱氢酶基因的表达,从而直接影响脂肪酸合成及与此有关的疾病的发生。③
PUFAs与生物活性物质的关系。PUFAs可以转化为某些生物活性物质的前体,如类二十烷、前列腺素、凝血黄素、白三烯等[1]。具体来说, GLA作为前列腺素的前体物质,具有抗动脉粥样硬化,降低血脂胆固醇浓度,降血压、抑制血小板凝集,增强免疫功能,保湿护肤等作用;AA能够保护皮肤,降低胆固醇,抑制血小板聚集,提高免疫力,促进胎儿发育等; EPA、DHA能抑制血小板凝集,减少血栓的形成,预防心肌梗塞和脑梗塞,降血脂,预防和治疗动脉粥样硬化,抑制肿瘤生长,抗炎,抑制过敏反应,另外, DHA主要存在于大脑和视网膜中,能保护视力,是婴幼儿眼的机能发育和大脑发育的必需物质[2]。
1　多不饱和脂肪酸的来源
1.1　动植物中的来源
大多数植物油以亚油酸( linoleic acid)为其主要的脂肪酸,如玉米胚芽油、棉籽油、燕麦油、芝麻油、大豆油、红花籽油和葵花籽油等。亚麻酸(linolenic acid)的部分来源为富含多不饱和脂肪酸的植物油,如大豆油、亚麻籽油和低芥酸菜籽油,亚麻酸与亚油酸常存在于同一植物油中,只是不同种类油中两者相对比例和含量差别很大。某些不常见的油,如月见草油、琉璃苣油和黑加仑籽油含有较高的γ-亚麻酸(GLA)。动物性食物,尤其是蛋黄肉、肝及其他内脏肉中,则含有花生四烯酸(AA),二十碳五烯酸(EPA)。AA广泛分布于动物的中性脂肪中,牛乳脂、猪脂肪、牛脂肪、血液磷脂、肝磷脂和脑磷脂中含量约为1%。在高脂鱼及海洋哺乳动物中EPA、二十二碳六烯酸(DHA)的含量最高。如鲱鱼(menhaden)鱼油中EPA占总脂肪酸的16. 03%,DHA占10. 83%[3]。
1.2　微生物中的来源
目前,被检测的所有微生物(细菌、酵母、霉菌、藻类等)都能产生油脂和不饱和脂肪酸,但各种微生物的产脂能力不同。产脂微生物种类如下。
1.2.1　细菌　嗜酸乳杆菌(L.acidophilusCRL640 )、
混浊红球菌(Rhodococcus opacus) PD630[4]、弧菌(Vibrio)CCUG35308[5]等。混浊红球菌PD630在葡萄糖或橄榄油中生长时,甘油酯中的脂肪酸含量占细胞干重的76~87%。弧菌CCUG35308脂肪酸主要为偶碳链脂肪酸(16∶0、16∶1、18∶1和20∶5),可用于EPA(20∶5n-3)的生产研究。
1. 2. 2　酵母　弯假丝酵母(Candida curvata)、浅白
色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、胶粘红酵母(Rhodotorula glutimis)、斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)等。一般油酸是酵母中最丰富的脂肪酸,其次是亚油酸。红酵母和假丝酵母可用于开发生产可可脂及其代用品。日本JP61282091报道,将一种假丝酵母进行摇瓶培养,其甘三酯组成中POP占18. 6%、POS占39%、SOS占14. 6%,可代替可可脂用于食品中。
1. 2. 3　霉菌　深黄被孢霉(Mortierella isabellina)、
高山被孢霉(Mortierella alpina)、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、土曲霉(Aspergillus terreus )、雅致枝霉(Thamnidiumelegans)、三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)等霉菌,特别是被孢霉属,主要用于研究生产GLA和AA;三孢布拉氏霉则主要用于发酵生产β-胡萝卜素,β-胡萝卜素是脂溶性维生素类。
1.2. 4　微藻　盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、粉核
小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、三角和指藻(Phaeodactylum tricornutum )、新月菱形藻(Nitzschia closterium)等。微藻主要用于生产EPA、DHA。
2　多不饱和脂肪酸的代谢途径研究
在酵母、真菌和藻类中,PUFAs的生物合成是以饱和脂肪酸-硬脂酸为底物,经碳链延长和脱饱和两个主要反应而来。18C以下的脂肪酸的合成在细胞基质中进行,以NADPH作为必需的供氢体,NADPH主要来自磷酸戊糖途径。18C以下的脂肪
酸的去饱和及碳链延长则是通过脂酰基连接到膜磷脂上完成的,需要NADPH和O2。已证明这些去饱和作用发生在真核生物的细胞膜上,磷脂是脂酰基去饱和作用的载体,磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇是去饱和的底物。脂肪酸的去饱和及碳链延长是在不同酶作用下进行的。如图所示1。
 

3　多不饱和脂肪酸的发酵生产
目前,一般认为要实现微生物发酵生产多不饱和脂肪酸的产业化,通常要解决以下问题: (1)高产稳定菌种的选育; (2)多不饱和脂肪酸的代谢调控方法及培养条件的优化; (3)发酵过程中动力学参数的确定与优化控制。
3.1　筛选和选育高产多不饱和脂肪酸的菌种
用于工业化生产多不饱和脂肪酸的菌株必须具备以下条件: (1)具备或改良后具备合成油脂的能力,菌体内油脂积累量大,含油量稳定在50%以上且油脂转化率不低于15%; (2)高效能利用农副产品及工业废水、废料作为营养基质和能量来源; (3繁殖力旺盛,杂菌污染困难,沉淀、过滤、分离油脂容易; (4)油脂风味良好,食用无害,易消化吸收; (5用于工业化生产时能适应工业化深层培养,装置简单[8, 9 ]。目前为能从诸多的微生物中筛选出能高产PUFA的菌株,主要方法有诱变育种技术、抗性筛选法、基因工程技术、原生质体融合技术等方法。用于生产多不饱和脂肪酸的微生物主要为藻类、细菌和真菌。由于细菌产量低,所以目前主要集中在真菌和藻类。真菌中高山被孢霉(Moriterella alpina)、长被孢霉(Mortierella elongata)、水霉(Saprolegnia)、轮枝霉(Diasporangium )、樟疫霉(Phytophthorcinnamomij)、毛霉(Mucor)、小克银汉霉(Cucocircinelloides )等含有EPA、ARA,被孢霉(Mortierella)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、鲁氏毛霉(M.rouxianus)等菌种含有γ-亚麻(GLA)。真菌在自然界分布广且易培养,所以目前从真菌中寻求高产菌株已成为众多研究者关心的问题,且前景广阔[10-13]。目前,日本、英国、法国、美国等地进行微生物产生多不饱和脂肪酸的研究,所用菌株多为被孢霉菌类,如深黄被孢霉(Mortierella isabellina),葡酒色被孢霉(M. vinacea),拉曼被孢霉(M.ramanniana),矮被孢霉(M. nana)[6],高山孢霉(M.alpina IS-4)[7]等,而以深黄色被孢霉及其突变株研究最多。其中丝状真菌因其生物量较大,含油量较高,并含有多种PUFAs,故具有很大的商业生产潜力。陈波等[14]以深黄被孢霉为出发菌株,经紫外线诱变处理,采用抗性筛选法,获得一株生产性能比出发菌株显著提高的突变株M80,其菌体收率达25. 10g/L、油脂产率达12. 35g/L、γ-亚麻酸(GLA)产率达771. 88mg/L。吕飒音等[15]通过紫外线诱变和甘草酸筛选,获得高产菌株被孢霉A02,其摇瓶培养生物量达20. 12 g/L,γ-亚麻酸产量为0. 96 g/L。张峻等[16]用紫外线诱变处理深黄被孢霉,获得一变异株M 6油脂含量为32. 8%, C2亚麻酸含量为8.84%。李春明等[17]对被孢霉进行原生质紫外线诱变,变异株的亚麻酸产量比对照组的亚麻酸产量提高53.6~ 70.7%。黄建忠等[18]以紫外线、硫酸二乙酯、亚硝基胍复合诱变,变异株M 108油脂含量达65.6%。这些研究表明,以产脂微生物为基础,通过简单的物理诱变、化学诱变即可获得高产变异株。各种微藻的PUFAs含量和合成能力有很大差异,因此,人们一开始就致力于寻找具有高含量PU-
FAs的藻株。用来筛选的藻类几乎涉及到已经发现的所有可以人工培养的微藻,如红藻(Rhodophyce-ae),褐藻(Phaeophyceae),绿藻(Chlorophyceae),隐藻(Crytophyceae ),黄藻(Xanthophyceae ),金藻(Chrysophyceae),硅藻(Bacillariophyceae),双鞭甲藻(Dinophyceae), Prasinophyceae, Eustigm atophycea等,通过研究发现,在许多海洋微藻和巨藻中都有高水平的EPA和DHA,相反,只有几种淡水藻含有相当量的EPA和DHA。Yongmanitchai等从培养中心得到藻株或从泰国淡水水库中分离藻株,筛选其生产EPA的潜力。从20株中筛选出Chlorellaminutis-sima U TEX2341和Phaeodactylum tricornutum UTEX640的EPA含量最高,各占总脂肪酸的31. 8%和30. 5%。P. tricornutum的生物量高达2484. 5mg/L,总EPA产量比其他任何藻株都高。
3.2　发酵培养多不饱和脂肪酸条件的研究
何东平等[19]以M. isabellinaAS3. 3410为出发菌株,经过稀释平皿分离法,两次紫外光诱变和三次紫外光、LiCl混合诱变,选出的突变株,经中试发酵的研究,获得高产的深黄被孢霉突变株,发酵生物量达49 g干菌体/L发酵液,含油率42. 75% ~47. 78%,产油量19. 7g/L发酵液,γ-亚麻酸5. 78%~6. 59%,花生四烯酸4. 6%,并确定了工艺技术路线。上海市工业微生物研究所[20]已完成中试,干菌体生物量3~5%,总脂肪得率40~50%;福建师范大学[18]与工厂合作在60m3发酵罐中试生产,利用菌株以M. isabellina AS3.3410为出发株的突变株M018株,采用三级发酵(即两级液体种子),使生物量达到37. 8 g干菌体/L发酵液,油脂产量达79. 2%,GLA产量在7. 0%左右,将菌体收集后,粉碎,制成胶囊,作为食品保健品出售。杜冰等[21]对破囊壶菌ATCC34304等四株菌的发酵液的分析,发现ATCC34304易于培养且DHA含量高,对ATCC34304的发酵培养基组分和发酵条件进行进一步研究后得出,在以淀粉为碳源的培养基中,28℃170 r/min摇床光照培养6 d, DHA含量达320·1mg/L。其他研究单位还有:辽宁省分析测试研究中心[22]、中国科学院上海植物生理所[6]、华南理工大学[23]、西安油脂科学研究设计院(固体发酵)[24]、南京师范大学[25]、曲阜师范大学[26]、南开大学[16]等单位,研究各有千秋。M.Grima和他的同事们报告了用金鞭藻在恒化器中进行培养,大规模生产EPA和DHA。他们认为:适于细胞大量生长的条件和高含量脂质的生产条件是相反的,生长速率最高的生长条件并不是EPA和DHA能达到最高含量的生产条件[27]。因此,必须进行动力学研究,以便对发酵过程进行代谢调节,提高多不饱和脂肪酸的发酵产量。
3.3　多不饱和脂肪酸浓缩提取方法的研究
通常用来提取多不饱和脂肪酸的方法有几种,特别是用来生产高含量的EPA和DHA。这些方法有:溶剂提取法、尿素包含法、真空蒸馏法、分馏法、液相色谱法和超临界二氧化碳提取法等。郑瞍等[28]人用刮膜式分子蒸馏装置对α-亚麻酸的提纯进行了研究。考察了蒸馏温度、系统压力、进料速率、进料温度、刮膜器转速等操作因素对α-亚麻酸产品纯度与收率的影响。经过四级分子蒸馏,可以将原料中的α-亚麻酸由原来的67. 5%提纯至
82. 3%。一般是将几种方法结合起来使用。根据EPA能够以脂质混合物或以脂肪酸的形式从菌体中提取,和发明了一种工业化提取EPA及其酯的专利,该专利提取的EPA可占总脂肪酸中EPA的93%,生产过程主要包括尿素包含和分馏。大多数提取鱼油中EPA的方法也可用于微生物脂质中EPA的提取。
4　结束语
当今世界包括中国需要解决人口、食品和环境三难题,在食品中减少粮食需求,增加肉类、脂肪及蛋白质等,尤其是具有人体生理功能食品的摄入量,此类食品更受青睐。近年在世界范围内掀起的第四代功能性食品即有效成分和生理功能清楚的功能性食品。而含多不饱和脂肪酸的油脂就是风靡世界的第四代功能性食品。目前,英国和日本已先后获得了产GLA菌和工业化生产,并使之成为商品在市场上销售。但ARA、EPA和DHA的微生物发酵尚处于实验研究阶段。由于人们健康意识的提高、微生物生产多不饱和脂肪酸的诸多优点和PUFA在市场上的高经济价值,相信以AA、EPA、DHA为主要产品的微生物发酵产业化将为时不远。