发酵中克拉维酸降解因素的探讨
2007-10-13 14:22:44   来源：中　国　生　物　工　程　杂　志   评论：0 点击：

　　克拉维酸是由棒酸链霉菌(StreptomycesclavuligerusATCC27064)产生的一种β-内酰胺酶抑制剂,它可与β-内酰胺酶的丝氨酸活性位点不可逆结合,从而保护β-内酰胺类抗生素的活性[1]。现今,克拉维酸在临床上的应用越来越广泛,其与阿莫西林复配使用是一个最成功的例子。克拉维酸在发酵过程中的不稳定性是影响其最终产量的一个重要因素。克拉维酸是一种次级代谢产物,其产量水平不仅受调控基因和合成相关基因等在分子水平的调节[2,3],以及次级代谢途径特殊的调节机制调节[4],还和一些发酵过程参数有关,如pH、温度、溶氧和搅拌等[5~7]。如发酵后期pH的变化是促使克拉维酸降解的一个重要因素,pH的最佳控制参数是6·5,高温可促进克拉维酸的降解。克拉维酸降解的原因至今尚不清楚,关于其在人体内的稳定性研究相对较多[7],而对于其在发酵过程中降解的研究报道则较少[8]。本试验主要是探讨发酵过程中影响克拉维酸降解的原因。首先,模拟培养基组成,研究外部环境因子(不同的培养基组分)对克拉维酸降解的影响;然后,研究菌体在对数生长期和稳定期时克拉
维酸的降解情况。
1　材料与方法
1·1　菌　种
带棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus, ATCC27064),由中山大学生命科学学院提供。
1·2　菌体培养
采用ISP1培养基活化菌种,于28℃、200r/min培养48h后,以5%的接种量转接发酵培养基,于28℃、200r/min培养。
ISP1培养基为:胰蛋白胨5g/L,酵母提取物3g/L,pH6·5。
1·3　环境因素对克拉维酸降解的影响试验
1·3·1　部分因析试验　本试验采用解析度为Ⅳ的部分因析设计,它的特点是:利用较少的试验次数,通过试验数据分析各因素对响应值的影响大小;同时合理地安排因素所在设计中的位置,可以使得某一因素与其他因素的交互作用全部体现出来。发酵培养基水平具体见表1。
1·3·2　培养基各组分对CA降解试验　将培养基中的各组分分别置于pH为6·5的MOPS缓冲体系的三角瓶内,并在每瓶中加入一定量克拉维酸,使其浓度约为300μg/ml。然后于200r/min、28℃培养。24h后分别取样检克拉维酸的含量。然后计算克拉维酸的降解速率常数。
1·4　克拉维酸在菌体对数生长期的降解试验
以5%的接种量接种发酵培养基,于200r/min、28℃培养10h后,加入克拉维酸标准品,使其终浓度为300μg/ml左右。一定时间取样,检测克拉维酸含量,计算克拉维酸的降解速率常数。
 

1·5　克拉维酸在菌体稳定期的降解试验
以5%的接种量接种发酵培养基,于200r/min、28℃培养,当菌体进入稳定期后,一定时间内取样,于5000r/min离心5min,收集上清液。把上清分为两份,其中一份于121℃灭菌25min。然后分别在两份液体中加入500μg克拉维酸标准品,使终浓度分别约为500μg/ml。20℃下,一定时间内检测克拉维酸含量,并计算克拉维酸降解速率常数。
1·6　克拉维酸的检测
1·6·1　培养基前处理[9]　取1·5ml的发酵液,加入
1·5ml乙腈,振荡摇匀,充分混合,再于12000r/min离心15min,收集上清液。在上清液中加入9ml二氯甲烷,振荡摇匀,于5000r/min离心5min。收集上清液,准备进行色谱衍生化处理。
1·6·2　克拉维酸样品色谱衍生化[10]　取0·1ml克拉维酸样品,加入50mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH7·3)至1ml,然后加入0·4ml的咪唑,振荡均匀,于30℃水浴10min,取15μl进行液相色谱分析。
1·6·3　克拉维酸检测方法　高效液相色谱法。
色谱柱: Waters C-18μ-Bondapak ( 3·9×300mm),流动相:50mmol/L KH2PO4/甲醇(88∶12,v/v),pH3·2,流速:1ml/min,检测波长:318nm。标品:安灭菌(克拉维酸∶阿莫西林=1∶5,g/g,华北制药厂)。
2　结果与讨论
2·1　培养基各组分对克拉维酸降解的影响
本试验主要探讨了培养基组分对克拉维酸降解的影响。培养基中的主要组分为MOPS、甘油、大豆粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和鸟氨酸。MOPS的加入主要是维持培养基的pH值,使其稳定在6·5。本试验采用27-3部分析因设计,试验设计中共有7个因子,每种因子有两个水平,共有16组试验。在每个摇瓶中加入一定量的克拉维酸,使其浓度约为300μg/ml。于200r/min、28℃培养,24h后取样检测克拉维酸含量,得降解百分含量。其设计与结果如表1。从表2回归分析及图1主效应图可知,在试验范围内,7个影响因素及其部分交互作用对CA的降解作用都不显著。其中MOPS、甘油、KH2PO4的单因素效应以及MOPS与甘油、大豆粉、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、鸟氨酸的交互作用为正效应,即加速了CA的降解,而大豆粉、MgSO47H2O、FeSO4·7H2O、鸟氨酸单因素效应以及MOPS与KH2PO4、甘油与大豆粉的交互作用为负效应,即减缓了CA的降解。
2·2　降解速率常数(kd)试验
降解速率常数试验设计如表3所示。在pH和温度一定的情况下,分别研究了甘油、KH2PO4、大豆粉、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、鸟氨酸在MOPS缓冲体系中对CA降解的影响。由前期试验可知,CA降解符合一级动力学反应。以试验A为对照,FeSO4·7H2O对CA的降解促进最大,降解速率常数kd为0·00581h-1,以下依次为MgSO4·7H2O、甘油、鸟氨酸和大豆粉,降解速率常数kd(h-1)分别为0·00554、0·00527、0·00460、0·00419,而KH2PO4具有减缓CA降解的能力,这与表2中MOPS与大豆粉各组分的正负交互作用是一致的。

2·3　克拉维酸在菌体对数生长期的降解试验
由前期试验知,发酵10h后,菌体生长进入对数生长期,到35h基本结束。在菌体对数生长期,CA的产量非常低,可以近似为0。试验结果如图2。
 

随着菌体量呈对数增加,CA不断降解。由一级动力学反应公式可得,在菌体对数生长期的C降解速率常数kd=0·00579h-1,且保持不变,这个结果与试验2·2的结果相仿。由此可见,对数生长期的菌体量虽然不断增大,但CA降解速率常数基本保持不变,且与培养基大部分单组分CA降解速率常数相近,因此,可以判断生物量对CA的降解
没有显著性的影响。
2·4　克拉维酸在菌体稳定期中的变化试验
由图3可见,已灭菌培养基上清液的CA降解速率常数kd基本保持不变,约为0·0055h-1左右这与试验2·3的结果相似。而未灭菌的培养基上清液CA降解速率常数kd随时间不断增大,到7达到0·01681h-1,然后趋于平稳。分析其原因,是未灭菌培养基的上清液中存在某些物质,可能是生物酶或者其他一些热敏感性物质,而这种物质的存在加速了CA的降解速率。

在CA的发酵培养过程中,通过显微镜观察可以看到,当细胞发酵20h后,菌丝体顶端膨大,开始出现了细胞自溶现象,而从2·3试验结果可知,对数生长期CA降解速率和稳定期灭菌培养上清液中CA降解速率比较接近,从而可排除胞内酶对克拉维酸降解有显著影响。因此,推测在菌体进入稳定期后,可能存在一种代谢调控机制,某种与CA生产相关的基因表达,这种酶本身或者其催化某种物质反应,加速了CA的降解。曾有研究表明,bla基因可能参与CA的代谢调控机制,与发酵后期CA的产量有关。或者是稳定期产生的某种代谢物。胞内酶的可能性不大,因为在发酵20h后,由于搅拌剪切作用,菌丝体就已经开始自溶释放胞内酶,但是试验2·3中(即对数生长期)的CA降解速率常数保持不变,并且其降解速率常数与已灭菌培养基上清液的降解常数大致相等,都可以排除胞内酶对CA降解有显著性影响。而菌体在稳定期的后期由于自身基因所决定的代谢调控机制,可能产生一种次级代谢产物,通过这种代谢物,菌体从而抑制CA产生或者促进CA降解[11]。
2·5　结　论
外界环境因子对CA降解速率的影响大小不同,单组分培养基在一定pH下不同程度地促进CA的降解,不同单组分的交叉影响可加强或减弱CA的影响。通过对棒酸链霉菌对数生长期和稳定期CA降解情况的研究,可以判断,在pH、温度等发酵条件一定的情况下,导致发酵后期CA严重降解的原因可能与菌体生长产生的热敏性物质或者稳定期产生的次级代谢产物有关。