富马酸的发酵工艺研究
2007-10-07 22:05:47   来源：本站原创   评论：0 点击：

　　富马酸(Fumaric Acid)又名延胡索酸(Fumar-ate)或反丁烯二酸(Trans-Butenedioic Acid),是生物体的重要中间代谢产物,同时也是一种重要的有机化工原料和大宗化工产品,广泛用于涂料、树脂、医药、增塑剂等领域,并可作食品添加剂和饲料添加剂.富马酸的生产方法主要有两种:一种是顺酐异构法,顺酐在催化剂(硫脲-硫酸、盐酸及溴氧化剂等)的作用下发生异构化生成富马酸,然后经过过滤、洗涤、干燥得成品.另一种方法是生物转化法,以液体石蜡为原料,假丝酵母为菌种进行深层发酵,然后经分离、脱色、结晶、干燥等多步工序得富马酸成品.此外,也可以用山芋、淀粉等原料发酵制取[1].1970年日本的曾由山田等人利用假丝酵母发酵正构石蜡生产反丁烯二酸获得成功,他们采用振荡培养,7 d后反丁烯二酸的产率为正构石蜡的65%[2].
随着石油资源的枯竭,利用生物转化的方法生产富马酸将是一条具有广阔前景的途径.本研究分别以可溶性淀粉和液体石蜡为发酵培养基的主要碳源,皱褶假丝酵母为菌种,研究了富马酸的发酵工艺.
1　材料与方法
1.1　菌种
皱褶假丝酵母(candida rugosaAs2.1369)(本实验室保藏).
1.2　培养基
斜面培养基:麦芽汁琼脂培养基(2%琼脂).市购生麦芽粉碎,称取500 g,加水2 000 g,于55℃糖化至加碘溶液不显蓝色为止(约6~7 h),以纱布过滤,装瓶加棉塞于0.15 MPa 15 min湿热使杂质沉淀.取出冷却,再经4层纱布过滤得麦芽汁.
种子培养基:麦芽汁培养基,不加琼脂.发酵培养基[3](g/L):液体石蜡(可溶性淀粉)60,尿素1, KH2PO4·H2O 0. 6, MgSO4·7H2O0.6,酵母膏0.5,CaCO350,其中尿素、CaCO3单独灭菌,接种时添加到培养基中.
1.3　培养方法
斜面培养:30℃恒温培养24 h,菌落形态呈白色蜡状.
种子培养:30℃恒温培养24h.发酵培养:发酵温度为30℃,摇床转速为140r/min,接种量2%,摇瓶装液量根据不同的发酵实验确定.
1.4　测定方法
1.4.1　富马酸的检测———高锰酸钾滴定法[4-9]
发酵液中富马酸含量=1/8(V0-V)C×116×10-3(g/L)其中,发酵液和空白液滴定消耗标准硫代硫酸钠溶液体积分别记为V(mL)和V0(mL);硫代硫酸钠标准溶液的浓度记为C.发酵液中富马酸对碳源的产率=发酵液中富马酸含量(g/L)/发酵液中碳源质量浓度(g/L)×100%.
1.4.2　pH值的测定
精密pH试纸(上海经济区试剂公司生产).
2　结　果
2.1　不同碳源对发酵产富马酸的影响以液体石蜡和淀粉作发酵培养基碳源,装液量150 mL/500 mL,接种量为2%,摇床转速为140r/min,培养温度30℃进行摇瓶发酵实验,24 h后开始取样分析,发酵液的pH和富马酸的含量随时间变化的数据如图1和图2所示.

由图1~2可以看出,随发酵过程的进行,富马酸的质量浓度逐渐增加,发酵液的pH值逐渐下降,发酵48h产酸最快,到60 h富马酸的质量浓度达到最大,此时发酵液的pH值基本不变,且以可溶性淀粉作碳源发酵产富马酸较高,故后面的实验中均以可溶性淀粉作为发酵培养基.
2.2　不同装液量对发酵产酸的影响
以可溶性淀粉作碳源,2%的接种量,不同的装液量(100 mL/500 mL,150 mL/500 mL, 200 mL/500mL)进行发酵实验,摇床转速为140 r/min,温度30℃,培养24 h后开始取样分析,富马酸含量随时间变化如图3所示.

由图3可以看出,若其他条件相同,装液量对发酵产酸影响很小,说明氧不是影响皱褶假丝酵母生长和产酸的主要因素.
2.3　接种量对发酵产酸的影响
以可溶性淀粉作碳源,装液量150 mL/500 mL不同的接种量(1%,2%)进行发酵实验,摇床转速为140转/min,培养温度为30℃,培养24 h后开始取样分析,发酵液中富马酸的含量随时间变化的数据如图4所示.由图4可以看出接种量为2%时发酵产酸效果较好,较高的接种量有利于缩短菌体生长的迟滞期,有利于富马酸的生成.
 

由以上数据可知:以可溶性淀粉作发酵培养基的主要碳源,接种量为2%,发酵60 h产富马酸质量浓度最高,达26.1g/L,富马酸对碳源的产率为43.5%,装液量对发酵的影响不大.
3　讨　论
(1)富马酸含量的测定方法有:示波极谱法、气相色谱法、反相高效液相色谱法和高锰酸钾滴定法,本实验采用高锰酸钾滴定法.高锰酸钾滴定法测定富马酸含量需注意:无论用较浓还是较稀的高锰酸钾标准溶液,测量值都比实际值偏高,这是因为在实际测定时,除了富马酸能与高锰酸钾作用外,发酵液中还原物质也会与高锰酸钾作用,在实验时应做空白实验予以消除.
(2)采用麦芽汁培养基做菌种扩大培养基效果较好,因为麦芽汁中富含微生物生长所需要的营养成分,以此作种子培养基接种到发酵培养基上发酵效果好.
(3)用液体石蜡作碳源的发酵过程产酸量低于淀粉作碳源的发酵过程,可能是因为液体石蜡属烷烃类物质,与培养基的其他水溶性成分不能很好混溶,在振荡培养过程中发酵液出现了分层现象,使菌体不能很好地利用液体石蜡,从而表现为产酸量偏低.用淀粉作碳源的发酵液发酵效果较好,经短时间发酵后发酵液黏度下降,菌体生长旺盛,产富马酸较多.
(4)在发酵过程中加入适量的CaCO3可以缓冲发酵液的pH,有利于消除对产物生成的抑制;CaCO3的加入量对产酸影响较大,若加入量过多,会出现CaCO3结块,发酵液分层现象,不利于富马酸的积累,较合适的CaCO3加入量为50g/L.
4　结　论
以皱褶假丝酵母为菌种,液体麦芽汁培养基作种子扩大培养基,以可溶性淀粉作发酵培养基的主要碳源,2%接种量,发酵60 h产富马酸浓度较高,发酵液中富马酸对碳源的转化率为43.5%,装液量对发酵的影响不大.实验对皱褶假丝酵母发酵产富马酸的工艺条件进行了优化,得到了较优的培养条件,对发酵培养基的优化和发酵液中富马酸的分离还在进一步的研究中.