雷帕霉素研究进展
2010-09-07 23:02:06   来源:本站原创   评论:0 点击:

对雷帕霉素的免疫抑制机理及发酵、纯化、检测方法、应用等方面进行了简述,以期为雷帕霉素的研究提供参考。

[摘  要]对雷帕霉素的免疫抑制机理及发酵、纯化、检测方法、应用等方面进行了简述,以期为雷帕霉素的研究提供参考。
    [关键词]雷帕霉素;免疫抑制剂;生产;应用
   

       雷帕霉素是一种新型的大环内酯类免疫抑制剂,具有高效免疫抑制作用,其IC50为环孢素A的1%[1]。雷帕霉素在机体细胞内起作用需要和免疫结合蛋白——FK 506(FK 506-Binding Proteins,FKBPs)结合形成复合物后,结合到哺乳动物细胞的Rapalnycin靶位(mTOR,一种关键的调控激酶)并抑制其活化作用[2]才能发挥其免疫抑制作用[3]。
1  雷帕霉素的发酵生产
    目前雷帕霉素的生产主要是采用发酵的方法,其发酵过程有以下特点[4]:(1)发酵过程分为菌丝生长和雷帕霉素生产两个阶段。前3天为生长阶段,需要大量氧;生产阶段位于发酵过程的第4天之后,这时氧的需要量减小。(2)发酵液粘度极高,当发酵过程供氧不足时,雷帕霉素的生产将停止。
    研究初期的发酵培养基所用的碳源是氧化淀粉,而使用这种碳源的发酵液粘度高,使丰富培养基的应用受到限制。但当时的菌株使用除淀粉以外的碳源完全不产生雷帕霉素。因此,育种中便以筛选能够利用非淀粉类碳源生成雷帕霉素的菌株为主,为了增加培养基中氧气的含量,也可以通过筛选低粘度菌株来解决[4]。
    1993年,美国Merck公司[5]通过微生物转化的方法转化为雷帕霉素,前期种子液培养后,发酵液最终产生了300 mg/L的雷帕霉素。印度科学家[6]从土壤中筛选了高产雷帕霉素链霉菌,且副产物极少,在高通气量的糊精培养基中通过补料分批发酵产生了300~310 mg/L的雷帕霉素。2004年,印度学者Vaid等[7]对一株链霉菌进行诱变,将植物油作为惟一碳源进行发酵,结果表明连续发酵144~192 h,雷帕霉素的产率可达到180~330 mg/L。
    在国内的雷帕霉素研究中上海农药研究所薛建萍等[8]在50 L发酵罐中装入35 L培养基,经过发酵产生150 mg/L的雷帕霉素。朱健等[1]用紫外、60Co、HNO2诱变获得hzsw-8-1123突变株,采用L16(44)正交实验,其单位得到了较大幅度的提高。强华等[9]从庆大霉素处理株中筛选到高产菌株C 14-1,其雷帕霉素的摇瓶发酵水平比原始株提高60%。研究发现[10]丙酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙酰基辅酶A可以形成内酯环,以便更好地形成雷帕霉素产物。因此,顾骏等[11]在发酵初期添加2.5 g/L的异亮氨酸(Ile),结果雷帕霉素产量提高了约59%。
2  雷帕霉素的分离
    由于雷帕霉素在菌体和发酵液中都存在,藤泽药品工业公司采用图1的方法分离雷帕霉素[4]:



                                                      图1
    朱健等[1]采用发酵液板框所得菌体丙酮浸泡,抽提液浓缩或加水稀释使丙酮浓度<50%(V/V),用大孔吸附树脂吸附,低浓度的丙酮解析,除去蛋白质、多糖及色素,再以高浓度丙酮解析。浓缩脱除丙酮,雷帕霉素不溶于水而形成沉淀,沉淀用乙醇溶解后结晶。初次结晶得到的纯度约为90%,乙醇重结晶1~2 次后,纯度可提高至95%。程元荣等[12]研究发现雷帕霉素主要存在于菌丝体内,因此采用如下方法获得结晶:发酵液离心得菌丝,先用酒精浸泡,过滤得提取液,蒸去溶媒,残渣改用乙酸乙酯萃取,萃取液浓缩后上硅胶柱层析纯化,洗脱液减压蒸干,乙醚结晶得到白色的雷帕霉素晶体。
  有的研究认为雷帕霉素在水溶液中容易发生互变异构,在非极性有机溶媒中可使雷帕霉素的化学类型保持稳定[4],但朱健等[1]认为雷帕霉素及其异构体在含一定量水的溶媒中结晶,只要控制好结晶条件,所得均为雷帕霉素晶体的一水合物。
    研究认为对结构类似的化合物如雷帕霉素与FR 901556(FRO 75451),根据不饱和键的有无和多少,用含硝酸银的硅胶柱可以进行有效的分离[4]。
3  雷帕霉素检测方法
    雷帕霉素的检测方法首先由藤泽药品工业公司建立其 HPLC条件:柱Lichrospher RP-18(e),4 mm×250 mm;流速2 mL/min;检测UV 215 nm;流动相:乙腈-水-磷酸=600∶400∶1,柱温50 ℃时峰型和反式异构体分离较好[4]。           
    朱健等[1]采用C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为0.1%磷酸-乙腈(35∶65),检测波长为230 nm,流速为1 mL/min,柱温为60 ℃。许明哲等[13]使用TSK gel ODS-80 TM柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),柱温采用(55±1)℃,流动相为水∶异丙醇∶四氢呋喃(5∶2∶2),流速0.6 mL/min;检测波长220 nm,进样体积为20 μL时雷帕霉素的色谱峰与其他杂质峰能够较好地分离。赵哗惟等[14]实验获得高效液相色谱法,确定流动相条件为0.1%磷酸溶液-乙腈(32:68),流速为1 mL/min,检测波长为205 nm,柱温为 50 ℃,测定结果表明,在10~100 μg/mL的范围内雷帕霉素浓度与峰面积呈现良好的线性关系。
4  雷帕霉素的临床应用
    雷帕霉素临床上主要用于肝肾移植[15],欧洲14个研究中心对接受Rapa/CsA+硫唑嘌呤(Aza)+泼尼松(Pred)治疗的肾移植患者进行研究,术后12个月时,人/肾存活率分别为97.5%、92.5%和94.7%、89.5%。两组肾活检证实的急性排斥发生率、接受抗体治疗的患者均相似,但雷帕霉素组肾功能恢复情况却优于CsA治疗组。而美国也在全球80个中心进行  1 295例肾移植实验,效果表明雷帕霉素副作用极小。
    雷帕霉素除应用于治疗肝肾移植外,在其他方面也有重要应用。Ponseti等[16]研究发现,通过使用雷帕霉素治疗重症肌无力,经过平均12个月的治疗,5%的患者达到稳定缓解而不需要其他任何药物治疗,87%的患者需要免疫抑制剂维持治疗达到临床缓解,无一例患者日常生活受到影响,平均39%的患者肌力明显增加。王晓辉等[17]实验发现雷帕霉素与FTY 720两者联合用药时,则能发挥协同抗胰腺癌细胞增殖作用。殷玉俊等[18]研究发现,MSCs联合雷帕霉素通过协同抑制淋巴细胞增殖、T淋巴细胞凋亡对BALB/c鼠T、B淋巴细胞有免疫负调节作用。赵新荣等[19]通过对48只新西兰白兔右眼碱烧伤制成新生血管模型的研究发现,0.5%、1%雷帕霉素滴眼液可有效抑制碱烧伤引起的角膜免疫炎症反应,抑制角膜新生血管的生长。
5  雷帕霉素的不良反应
    雷帕霉素的不良反应主要为肾毒性。肾损害多发于用药初期,停药或减量可逆转。患者有头痛、失眠、震颤、肌痛、乏力等神经毒性,也可出现一过性的血糖升高。此外,比较常见的不良反应还包括高血压、视觉异常、便秘、腹泻、高血钙、白细胞增多等[15]。詹胜利 等[20]共收集国内外4个随机对照研究,经过统计发现副作用主要表现为血脂升高。研究显示,移植后10年内有10%的患者罹患恶性肿瘤,20年内更是高达  40%[17]。
6  前  景
    国内外研究进展发现,人们虽然对雷帕霉素的发酵生产存在原始菌株产雷帕霉素能力低下、发酵周期长、中间产物多、高浓度产物和底物抑制、发酵液分离提取复杂等问题,但是雷帕霉素比现行临床广泛使用的环孢素的免疫抑制活性强数十倍,而肾毒性低得多,且无神经毒性。此外曾有研究显示此类药物还能延长酵母菌、线虫、果蝇等无脊椎动物的寿命,因此,雷帕霉素在医学领域具有广阔的应用前景。

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