高密度发酵制备重组人 OCIF 活性域多肽融合蛋白
2010-06-20 19:46:17   来源：本站原创   评论：0 点击：

 
张兴群 1 王梁华 2 焦炳华 2 袁勤生 1 
1 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 上海 200237
2 第二军医大学基础部生物化学和分子生物学教研室 上海 200433 

摘  要    目的  利用原核重组表达系统 , 完成人破骨细胞形成抑制因子活性域
(Osteoclastogenesis Inhibitory Factor Active Domain, OCIF —AD) 可溶性融合表达中试
方法  OCIF AD 编码区基因插入大肠杆菌表达质粒 pMAL c2 中编码麦芽糖结合蛋白
Maltose - binding Protein,MBP 的 MalE 基因下游 构建重组融合表达载体 pMAL OCIFAD
及用于表达融合蛋白的工程菌株 在 3.7 升发酵罐上进行补料 分批发酵 发酵过程中 溶
解氧控制在 30 50% 接种量为 5% 表达分为两个阶段 37 培养 2 4h, 进行菌体生长
然后 加入 IPTG 诱导表达 6h 发酵结束 对菌体上清液进行直链淀粉树脂亲和层析 结果
发酵液的最终菌体密度 OD 600  达到 12.5 相当于每 升发酵液含有 35g 湿菌体 OCIFAD 融合
蛋白占菌体总蛋白的 45% 左右 含量超过 0.9g/L 其中 所表达的 OCIFAD 融合蛋白 40% 在
上清而直接显示有生物活性 60% 以包涵体形式存在 上清用亲和层析法一步纯化 纯度达
到 70% 以上 包涵体超声破菌后经两次洗涤 纯度达到 80% 以上 结论  OCIFAD 在大肠杆菌
中实现了融合高表达 
关键词  破骨细胞形成抑制因子  融合表达  发酵  补料 —分批培养 

Higher Density Fermentation of Recombinant Human OCIF Active Domain Peptide Fusion
Protein
Zhang Xing-Qun1 ,  Wang liang-Hua2, Jiao Bing-Hua2,  Yuan Qin-Sheng1
(1 State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science
and Technology,Shanghai 200237,China;2 Department 
of Biochemistry and Molecular Biology,Department of Basic Medicine,Second Military Medical
University,Shanghai 200433,China)

Abstract    Objective  To overexpress recombinant human recombinant osteoclastogenesis
inhibitory factor active domain(OCIFAD) fusion protein by higher density cultivation of E.coli
TB1/pMAL-OCIFAD in 3.7 L Bioengineering Fermentator. Methods  The gene of OCIF active
domain code was inserted into expression vector pMAL-c2. The recombinant plasmid
pMAL-OCIFAD was obtained. A feeding-inbatch process was used to limit glucose at lower level
and keep dissolved oxygen at 30-50%;the bacteria grew at 37  for 2 - 4h,then added IPTG to
induce for 6h.OCIFAD fusion protein was isolated from the supernatant of bacteria
by affinity chromatography on Amylose Resin.  Results  The bacteria were reproduced
in a large scale at the final cell density of OD600=(approximately 35g wet weight
bacteria cell/L). Expressed OCIFAD fusion protein accounted for about 45% of total
bacterial protein, which represented for 0.8g/L of f inal product. OCIFAD presented
as 45% soluble form in supernatant and as 55% insoluble form in inclusion bodies. 

张兴群 1963 男 博士研究生 副教授 
联系作者 袁勤生 男 教授 博士生导师 Tel:021 - 64252255  E-mail:qsyuan@ecust.edu.cn 
The purity of OCIFAD fusion was more then 70% after affinity chromatography on
Amylose Resin, while the purity of inclusion bodies exceeded 80% through ultrasonic
and 2 steps of washing. Conclusion  The recombinant OCIFAD fusion protein wawww.gxqingyuan.coms highly
expressed in E.coli  TB1 by higher density cultivation with f eeding - inbatch protocol. 
Key Words  OCIF  Fusion protein  fermentation  Feeding-inbatch

    破骨细胞形成抑制因子 (Osteoclastogenesis Inhibitory Factor  OCIF 或称
(Osteoproteorin,OPG) 是最近发现的一种可以调节骨密度的糖蛋白 1 2 属于肿瘤坏死因子
受体超家族成员 其调节作用是通过抑制破骨细胞的形成 抑制成熟破骨细胞的活性并诱导
其凋亡而实现的 妇女绝经 过量服用糖皮质激素等因素引起的骨质疏松和 Paget ’s 病 癌
症的骨转移导致的骨破坏都与破骨细胞分化增殖的异常活跃和骨吸收功能过量密切相关 3
对 OCIF 的研究必将为诸如骨质疏松 类风湿关节炎 癌症的骨转移 4 5 及其他骨骼类疾病
发病机制的了解 预防和治疗提供帮助 
为了研究 OCIF 的功能和相关的作用机制成为可能 本研究在获得 OCIF 活性结构域克
隆与表达的基础上 进一步考察了实现发酵 罐高密度发酵表达可溶性 OCIF 融合蛋白的各种
参数 通过优化发酵 实现了其高表达 

1  材料与方法 
1 1  材料 
1 1 1  菌株和表达质粒    宿主大肠杆菌 TB1 ara ( lac pro AB) rpsL ( 80 lacZ
M15) hsdR 由本室保藏 含有 OCIF 活性域编码序列片段的重组质粒 pMAL OCIFa 由本实验
室构建 过程如下 委托生工生物工程公司合成用于合成 OCIF 成熟肽的 5 端引物 引入
EcoR1 酶切位点和起始密码子 ATG  TTG GAA TTC ATG GAA ACG TTT CCT CCA AAG
和 3 端引物 引入 Sal1 酶切位点和终止密码子的互补序列 ATC GTC GAC TTA GGA ACA
TAT GTT GTC GTG PCR 扩增得到 OCIF 活性域 D1 D4 的编码序列片段 EcoR1 和 Sal1
双酶切 PCR 的胶回收产物和表达质粒 pMAL c2 胶回收酶切产物 用 T4DNA 连接酶连接
将 OCIF活性域编码序列片段 OCIFa克隆于麦芽糖结合蛋白 Maltose binding protein MBP
编码基因 malE 的下游 并使读码框正确 构建成可融合表达 OCIF 活性域编码序列的重组
质粒 pMAL OPGa 它带有氨苄青霉素抗性基因和编码人 OCIF 活性域的片段和 malE 的融
合基因 在编码基因上游具有可调控的 Ptac 强启动子 在安慰诱导剂 异丙基 D 硫代
半乳糖苷 IPTG 的诱导下 OPGa 片段和 MBP 融合表达 用该质粒转化大肠杆菌宿主菌
TB1 得到工程菌株 E.coli /pMAL OPGa 试管中 OCIFa 的表达量约为菌体总蛋白的 35% 以上 
1 1 2  培养液  LB 液体培养基用作试管种子培养 2 YT 液体培养基用作二级种子培养
半合成培养液用于发酵罐中的补料分批培养 LB 培养液中含有 g/L 蛋白胨 10 酵母粉
5 NaCl 5 2 YT 培养液含有 g/L 蛋白胨  16 酵母粉 5 KH 2 PO 4  2, K 2 HPO 4  4, Na 2 HPO 4 12H 2 O
7, (NH 4 ) 2 SO 4  1.2, NH 4 Cl 0.2 和微量元素溶液 该溶液中含有 g/L : MnSO 4 5H 2 O
0.001,CaCl 2 6H 2 O 0.004, Na 2 MoO 4 2H 2 O  0.002, ZnC l 2  0.002, CuSO 4 5H 2 O 0.001, H 3 BO 4 
0.0005, FeSO 4 7H 2 O 0.02, CaCl 2 2H 2 O 0.02, MgSO 4 7H 2 O  0.3 补料基质中含有 g/L :
葡萄糖 200 酵母粉  70 蛋白胨  70 MgSO 4 7H 2 O 5.7 培养液的 pH 全部调为 7.0 各种培
养液中都加入氨苄青霉素至 100 l 
1 2  细菌培养方法 
1 2 1 菌种制备 一级种子  发酵菌种选用新近转化和鉴定的菌种 质粒 DNA 的提取纯
化 感受态细胞的制备以及质粒的转化 菌株的纯化 单菌落挑 选等操作参照文献 挑
取 LB 平板上的单菌落接于 LB 液体试管中培养过夜作为活化的一级种子 
1 2 2 三角瓶培养 二级种子制备    取一级种子 以 5% 接种量接入到含 100ml 2 YT
培养液的 500ml 三角瓶中 30 220r/min 培养 6h 作为 3.7 升发酵罐 Bioengineering
的菌种 
1 2 3 发酵罐中分批补料培养  按发酵罐工作体积的 5% 接入二级种子 培养分两个阶段
第一个阶段为菌体生长阶段 培养时间为 2 4h 当培养液 OD 600 达到 0.6 后 加入诱导剂 异
丙基 D 硫代半乳糖苷 IPTG 至终浓度为 1mmol/L 即为诱导表达阶段 诱导时间
为 6h 分批补料方式 参照常规的补料方法并结合基因工程菌发酵的实际经验经优化改进
后进行 细菌接种培养 2h 后 开始连续流加补料基质 流加速度为 0.5ml/min 诱导开始
后提高流加速度为 1ml/min 同时 手动调节增大空气流量和搅拌转速 使溶解氧在 30% —50%
之间 
1 3  分析方法 
1 3 1 菌体浓度和质量  菌体浓度用分光光度计在 600nm 波长处测光密度值 OD 600 发
酵菌液经 3000 g 离心 15min PBS 重悬菌体 2 次 称量菌体重量 菌体干重测定如下 取
不同 OD 600 的菌液 10ml 3000 g 离心 15min PBS 重悬菌体清洗两次 105
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烘干至恒定值
称量细胞干重 光密度值与菌体干重呈线性关系 一个单位的 OD600 约为干菌 0.40g/L 而
1g 湿菌相当于 0.2g 干菌体 
1 3 2 表达上清液中 OCIF 活性域多肽的纯化  以直链淀粉树脂亲和层析对发酵上清液中
的目的蛋白进行纯化 
1 3 3  包涵体 OCIF 活性域多肽的初步纯化  将离心得到的菌体按 1 10 m/V 悬浮于
STE 中 20mmol/L Tris - HCl pH8.5,1mmol/L EDTA, 0.3 mol/L 蔗糖 于 0 冰浴中反复超
声 10min 10000 g 离心 30min 收集包涵体 将包涵体按 1 20 m/V 悬浮于洗涤液中
20mmol/L Tris - HCl pH8.5,1mmol/L EDTA, 0.2% Triton X - 100 于冰浴中超声 5min 充
分破碎洗涤 将包涵体悬浮于 TE 中 20mmol/L Tris - HCl pH8.5,1mmol/L EDTA 超声洗涤
5min 离心收 集包涵体 
1 3 4  OCIF 活性多肽融合蛋白表达量的测定  取相当于 OD 600 =0.5 的菌液 1ml 3000 g
离心 5min 弃上清 沉淀悬液在 50 l 去离子水中 再加入 20 l 2 SDS 上样缓冲液 混
匀后煮沸 5min 10000 g 离心 10min 取上清 15 l 行 SDS PAGE Hoefer SE250,Amersham
Pharmacia 分析 凝胶经考马斯亮蓝染色液 0.25% 考马斯亮蓝  R250 10% 乙酸 12% 乙醇
加温染色 20min 加温脱色 脱色液 10% 乙酸 12% 乙醇 30min 可见清晰的蛋白条带
扫描估算 OCIF 融合蛋白占菌体总蛋白的含量 Syngene 凝胶成像系统 
1 3 5 菌体总蛋白和包涵体蛋白总量的测定  取菌液 10ml 3000 g 离心 15min 得菌体
PBS 清洗两次 超声 10min 破碎菌体 取样按 Bradford 标准方法测蛋白含量 最终平均值
为每克干菌体相当于 0.5g 蛋白质 将包涵体溶解在 8mol/L 尿素中 离心去除不溶物 按同
样的方法测蛋白含量 算出包涵体的总蛋白量 
1 3 6 OCIF 活性域多肽融合蛋白生物学活性初步测定 
    将重组人 OCIF AD 融合蛋白用于干预从 Spaque Dauley(SD) 新生大鼠分离出的破骨细
胞 干预后 1 3 7d 取细胞玻片 皮质骨片进行 HE Giemsa 甲苯胺蓝染色 并观察抗
酒石酸酸性磷酸酶 TRAP 染色阳性细胞和骨片吸收陷窝 
2  结果 
2 1 pMAL OCIFa 重组表达质粒的构建和鉴定 
    将 PCR 扩增产物胶回收后以 EcoR1 和 Sal1 双酶切 克隆到 pMAL c2x 相应的酶切位
点中 转化大肠杆菌 TB1 感受态细胞 挑取 PCR 筛选阳性克隆子经小量培养后 抽提质粒
进行双酶切鉴定 获得重组表达质粒 pMAL OCIFA 图 1 
2 2 补料分批培养  在发酵罐中分批连续流加补料基质 培养过程中菌体密度 OCIF 活性
域多肽融合蛋白比率及实际含量参数的变化情况如表 1 所示 结果表明 细菌处于对数生长
中期或中后期 OCIF 活性域多肽融合蛋白的产率最高 菌体密度为 OD600=12.5  OCIF 活
性域多肽融合蛋白含量为      g/L  2.5 h 后持续诱导表达 结果表明第 6 小时就达到 OCIF
活性域多肽融合蛋白的最大www.gxqingyuan.com表达量 50 % 并且菌体也不再明显增加 此后 细菌开始自溶
密度有下降的趋势 因此在发酵罐中的发酵工艺应是在细菌 对数生长的中后期开始诱导 6h
后诱导结束 

         
图 1  表达质粒 pMAL OCIFA 的 双酶切鉴定 
Fig1. 1% agarose gel electrophoresis of restriction endonuclease digested  of
expression plasmid pMAL OCIFA
        M  GeneRuler 100bp DNA ladder plus
            1  pMAL OCIFA digested by EcoR1 and Sal1.
          2.  recombinant plasmid pMAL OCIFA
            3.  pMAL OCIFA digested by EcoR1 and Sal1.

表 1 Bioengineering 3.7L 发酵罐中 30 时 培养时间对 OCIF 活性域多肽融合蛋白产量的影响 
Table 1 Yield of OCIF active domain fusion peptide in Bioengineering 3.7 L fermenter during cultivation
Culturing time (t/h) Parameters of yield
3 4 5 6 7
Cell density[D(600)] 4.8 6.4 8.5 11.2 13.5
OCIFadfp(mB/%) 40 40 37 28 20
Content of OCIFa/ B/g.L-1 (a) 0.284 0.512 0.629 0.627 0.540
a Actural content of OCIFadfp calculated from D(600)×0.4 g/L bacterial dried mass×0.5
( protein/dried bacteria)×expression%

利用补料连续流加分批培养方法 得到了稳定的发酵结果 菌体的 OD 600 =11 —12
OCIFadfp 的表达量为 40% 左右 表达产物 OCIFadfp 有 30% 在上清液中且直接有生物活性活
性 70% 呈包涵体形式 上清用直链淀粉树脂亲和层析一步使其纯度达到 80% 以上 进一步
纯化纯度达 95% 以上 另文报道 包涵体纯化步骤较简单 超声破碎菌体后经两次洗涤
纯度就达到 80% 以上 基本可满足 OCIFadfp 中试的需要 
2 3 发酵产物的活性观察    初步测定了重组人 OCIFAD 融合蛋白的生物学活性 结果表明
从第 7 天开始破骨细胞在骨片上形成的吸收陷窝明显减少 破骨细胞活性受到抑制 
3  讨论 
对 TB1/pMAL —OCIFadfp 的发酵和纯化进行了初步探索研究 认为技术的关 
键在于补料的控制 采用补料连续流加分批培养和控制溶解氧的培养方法容易实现基因工程
菌的较高密度培养和产品的高表达 为了进一步提高 OCIFadfp 发酵的生产率 我们曾通过
延长培养时间 提高培养液中氮源物质浓度等方法 使菌体密度增大到 OD=14 左右 但目标
蛋白的表达量并未明显增加 只有 20% 左右 OCIFadfp 产量反而有所下降 表 1 分析其
中的原因可能是由于补料时营养物质特别是葡萄糖的量补加过多