A链21位Asn缺失胰岛素的分离纯化及性质研究
2010-05-20 10:36:26   来源：本站原创   评论：0 点击：

　　作为治疗糖尿病的特效药及其在生物化学上的特殊地位，胰岛素（Human Insulin, HI）的研究受到各国的重视。八十年代以来，随着生物技术的迅猛发展，化学修饰、基因重组等先进手段被用于产生新的胰岛素突变体，以此考察其结构与活性的变化，研究其结构和功能的关系。因为，只有在充分了解一个蛋白质结构与功能关系的基础上，才能进行有目的地改造，以求获得高效、长效、速效而又廉价的新型胰岛素产品。许多研究发现，A21Asn在酸性溶液中易于水解脱酰胺和形成二聚体，它构成了胰岛素制剂在纯度和保存中的重要问题。A21Asn在目前已知的所有不同种属动物胰岛素中都是恒定的，据此有人推测A21Asn是胰岛素活性的重要残基。但是它被多种氨基酸残基取代后都可获得较高活性，而且分子的稳定性得以提高^[1,2]，特别是A21Asp，A21Ser和A21Gly是目前已知的血液中半衰期最长和临床效用最好的几种突变体^[3]。这表明A21Asn并不是与胰岛素受体结合并发生生物效应的关键因素。那么A21Asn在胰岛素分子中到底有何作用？缺失它对胰岛素的生物活性有无何影响？缺失它是否也会改变其易于脱酰胺的特性，从而获得稳定而高效的胰岛素突变体？本实验探讨的目的正在于此。

　　菌种E.colil DH_5a 由北京大学蛋白质工程实验室提供；表达质粒pBV220由预防医学科学院病毒所侯云德教授赠送；A链21位缺失胰岛素原基因：由北京大学蛋白质工程实验室提供；胰岛素放射免疫测定盒：北京海科锐生物技术中心研制；人胎盘膜胰岛素受体按文献[4]制得。

　　胰蛋白酶，人胰岛素标准品均为Sigma公司产品；羧肽酶B（CPB）由北京大学生命科学院茹炳根教授赠送；RNA酶，T₄DNA连接酶为华美公司进口分装；其余试剂均为国产分析纯产品。

1.3.1 连接与转化反应 参照文献[5]将A21位 Asn缺失胰岛素原基因克隆入表达载体pBV220中，然后转化入E.coil DH5α菌株。用小量表达的方法对转化产物进行检测。

1.3.2 高密度发酵条件下的表达 挑取单菌落于5ml LB(Amp⁺)中37℃培养12h后，稀释到500ml培养8h～10h，加入10 L发酵罐中。控制培养温度为32℃，培养液pH7.0, 溶氧不低于接种时的50%，定时取样测定菌体浓度。当O.D_600nm 大于1.2时，以平均200rpm/h 速率加入补料，并用氨水调节其pH值。当O.D_600nm达20时，升温至42℃诱导。约1.5h后，停罐取出培养液，离心收集菌体，-20℃冻存备用。

1.3.3 小规模分离纯化 参照文献[6]，对表达产物经过超声波破碎或高压匀浆破碎、包涵体裂解、等电点沉淀、二硫键还原及A、B链重组等后加工过程后，得到突变胰岛素原。

1.3.4 突变胰岛素原的酶切 经过胰蛋白酶和CPB的联合酶切作用后，A21位 Asn缺失胰岛素原被活化为A21位 Asn缺失胰岛素。

1.3.5 突变胰岛素的分离纯化 取一定量的突变胰岛素原，于0.05ml/L Tris-HCl(PH7.2)缓冲液中，在合适比例的蛋白酶及1/300CPB的作用下，37℃反应半小时，立即冷却终止反应。HCl调pH2.5～3.0,加入NaCl使之终浓度成为12% 。盐析沉淀溶于0.05ml/L Tris-HCl(pH7.2)，40%异丙醇中，上样Resource^TMQ（1ml）阴离子交换柱， 以同样缓冲液洗脱，NaCl 盐梯度为0mmol/L～0.15mmol/L。以标准胰岛素为对照，收集相应的胰岛素突变体的峰。用0.5mol/L醋酸透析除盐，冻干备用。

1.3.6突变胰岛素的性质分析 对纯化后的突变胰岛素进行氨基酸组成分析及15%的Native-PAGE电泳分析。

1.3.7 突变胰岛素的活性测定 胰岛素受体活性测定（RBA）按文献[7]进行，放射免疫活性测定（RIA）按试剂盒提供的方法进行。

　　本实验从连接产物的转化盘中任意挑取10个菌落，用小量表达的方法对连接产物进行检查。表达质粒pBV220是一高效表达的温度诱导型质粒，A21Asn缺失胰岛素原基因插入pBV220的EcoR和BamH之间。由图1可看出B-J较之A来说，增加了一条分子量较小的带，说明本实验成功的实现了A21Asn缺失胰岛素原基因在表达质粒pBV220中的直接克隆。

　　将表达质粒pBV220转化入E.coil DH5α菌株中，42°C温度诱导表达，用高密度发酵法，每升发酵液可得湿菌体40 g～60g，表达量约为8%-15%（图2）。按文献[6]进行后加工处理，再经Sephadex G50(3×100cm)柱层析(图3)，收集峰2，冷冻离心后获得纯化的目的胰岛素原。一般100g湿菌体可得到约80mg～100mg的突变胰岛素原。对纯化后的突变胰岛素原进行SDS-PAGE电泳图谱（图4）分析及对其进行氨基酸组成测定，表明纯化后的突变胰岛素原为A21Asn缺失胰岛素原（表1）。

　　以标准胰岛素为对照，用不同质量比的胰蛋白酶和1/300的CPB对A21Asn缺失胰岛素原酶切，然后进行15%Native-PAGE分析。由图5中，可看出当胰蛋白酶与胰岛素原比为1/200时所得到的胰岛素含量最高，且酶切后所得的A21Asn缺失胰岛素与标准胰岛素的电泳条带极为相似，表明其分子内二硫键的配对是正确的。

　　A链21位缺失胰岛素原在胰蛋白酶和羧肽酶B的作用下，释放出C肽及其两端的双碱性氨基酸产生胰岛素。选择合适的胰蛋白酶比例（此实验中是1:200），对A21Asn缺失胰岛素原进行酶切，然后经阴离子交换柱Resource^TM Q（1ml）进行分离纯化，得到高纯度的A链21位缺失胰岛素。对纯化后的突变胰岛素进行氨基酸组成分析，所得结果与理论值一致(见表2)。说明得到的胰岛素为A链21位缺失胰岛素。

　　以标准胰岛素为对照，对纯化的A21Asn缺失突变胰岛素进行15%Native-PAGE分析。结果表明（图6）：此突变体的电泳迁移率较标准有明显降低。同时，以人胰岛素为标准，进行突变胰岛素的受体活性及放免活性的分析（图7），其受体结合活性为7.76%，放免活性为5.13%。

3 讨论

　　胰岛素是一种功能广泛的多肽激素，由于胰岛素对糖尿病特效的医疗作用以及其结构功能特点，使得它在医学、生物化学及分子生物学的发展中一直占有特殊的地位，而胰岛素结构与功能的关系一直是人们研究的热点。许多研究发现，A21Asn在酸性溶液中易于水解脱酰胺和形成二聚体，它构成了胰岛素制剂在纯度和保存中的重要问题，在设计长效、高效的胰岛素突变体时，必须兼顾其稳定性，方可保证临床治疗上的价值。因此，A21Asn的功能研究受到人们的重视。

　　本实验成功地将A链21位缺失胰岛素基因直接克隆至表质粒pBV220中，并转化入E.coil DH_5a 宿主菌，成功获得A链21位缺失胰岛素。对其进行一系列的检测和分析。从实验结果中可看出A21Asn缺失胰岛素的迁移率明显降低，暗示了突变体的结构有所变化，这可能由于胰岛素原本紧凑的结构由于A链Asn的缺失而变得松散，引起原本在分子内部的正电荷的外露。同时，A21Asn的缺失也使胰岛素减少一个负电荷，使A21Asn缺失胰岛素在Native-PAGE中的迁移率降低。

　　突变体的放免活性为5.13%, 几乎丧失了全部的免疫活性，说明A21Asn缺失影响了它与其它氨基酸之间的构象联系，从而使胰岛素分子的空间结构发生改变，而这种变化涉及参与胰岛素抗原决定簇组成的结构要素，抗原决定簇的结构微区发生变化，必然影响其免疫活性。因为受到最直接影响的结构区域是A链C端，所以有理由认为A链C端很有可能是胰岛素抗原决定簇的组成部分。

　　突变体的受体结合活性为7.76%。这一结果表明A21Asn并不是胰岛素表现生物活性所必需的关键氨基酸，但它的缺失却会带来生物活性的大幅度下降，这表明A21Asn 在维持胰岛素发挥其生物功能所必需的特定空间结构方面有重要作用。人们一直认为，胰岛素与受体的结合发生胰岛素分子的一个两性表面上，其中部是由一系列疏水基团组成的面积约为150埃的疏水区域，这是胰岛素与受体结合并维持其稳定性的重要结构因素，只要这个疏水区的面积维持在150埃左右就不会过于严重地影响受体活性。A21Asn的缺失使胰岛素与其附近的A19Tyr等分子之间的范德华力消失，导致分子结构松散，疏水内核外露而使整个疏水区变小，从而导致整个胰岛素突变体生物活性的下降。

　　同时A21Asn的重要性来自该残基的主链，其作用主要是结构性的，即维持分子的一定重要部位的特征结构所必须的。在天然胰岛素分子中，A链C端存在A21-NH和B23-CO间的氢键，这里的氢键看来至关重要，可能对稳定B20-B23这一特征的b 回折结构有重要意义，而B20-B23这一b 回折结构和稳定B链C端的构象与胰岛素分子的生物活性密切相关^[9]。

　　由以上分析可看出A21Asn在维持胰岛素发挥其生物功能所必需的特定的空间结构的重要作用，表明胰岛素A21Asn是不可缺失的。这一结论为胰岛素基因工程的研究提供了重要的理论依据。