葡聚糖多克隆抗体制备与纯化
2010-01-06 21:58:57 来源：本站原创 评论：0 点击：
| 2009年第11期（总第132期） | ||
| 曾练强1，王生育2，李雨虹1，颜江华2，黄霄红2，梁达奉1，3（1.广州甘蔗糖业研究所 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东 广州 510316； | ||
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【摘 要】 以Dextran T40和BSA的交联物为抗原，多次免疫新西兰白兔，收集血清，并用rProtein A亲和层析柱纯化抗体，成功获得较高纯度的兔抗葡聚糖多克隆抗体。用ELISA法测定其效价，抗体效价为1∶32000以上。
【关键词】 葡聚糖；免疫；多克隆抗体；亲和层析柱纯化
1 前言
葡聚糖的存在给制糖工艺过程从蔗汁澄清到糖的精炼带来不良影响，如粘度增大，过滤困难，增加能耗，糖分测定时存在旋光度虚假增高的现象等，同时葡聚糖含量过高的糖产品在适用性上受到限制，且售价也会降低。
为消除葡聚糖在制糖工业的不良影响，定量检测其含量非常重要。但葡聚糖的快速准确定量检测目前还是一个难题。免疫学检测法是一个很有希望的方向，它不要求从样品中预分离葡聚糖，具有简便、准确、灵敏度高等优点，适合于制糖工艺任一工序中葡聚糖含量的测定。目前国外已有部分糖厂采用免疫法进行生产检测[1]，但由于所需要的抗体相当昂贵，在国内的糖厂还没有被使用的报道。
为建立葡聚糖的免疫学检测方法，本研究用Dextran T40和BSA的交联物免疫新西兰白兔获得多克隆抗体，纯化并检测其效价[2]。
2 材料与方法
2.1 供试材料
Dextran T40、T2000为Pharmacia公司产品。rProtein A 为SepharoseTM 分装产品。完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、OPD、BSA、OVA、Goat anti-rabbit IgG-HRP购自SIGMA公司。其它试剂为国产试剂。
2.2 葡聚糖多抗的制备
2.2.1 Dextran T40和BSA、OVA交联物的制备
按合适比例将BSA与Dextran 40混合，用水溶解调至6% (W/V)冷冻干燥。研磨成粉末状后放置60℃下恒温，保持相对湿度79%，并在容器底部放置饱和的KBr溶液，时间0～7d[3]。每天取样进行SDS-PAGE电泳，过碘酸-Schiff试剂法染色[4]和考马斯亮兰R250染色鉴定。得到Dextran T40-BSA交联物。用同样的方法制备Dextran T40-OVA。
2.2.2 葡聚糖多抗的制备
将Dextran T40-BSA交联物与等量完全福氏佐剂混合并充分乳化，经背部皮内多点注射成年雄性新西兰白兔,每次抗原剂量为1000μg/只。2周后以等量不完全福氏佐剂进行第2次免疫,之后每隔2周加强免疫1次，3次免疫后采血测定血清中抗体的效价。采血前3d,耳静脉加强免疫，剂量为500μg/只。颈动脉插管放血,分离血清,置-20℃保存。
2.3 葡聚糖多抗的纯化
用Buffer A（0.05M Boric ocid，4.0M NaCL，PH9.0）平衡rProtein A亲和层析柱，加少量的血清，用Buffer B（0.05M Sodium phosphate, 0.05M Sodium citrate, 0.3M NaCl, pH3.0）洗脱，收集蛋白进行效价测定。
2.4 兔抗Dextran T40抗体的效价测定[5]
采用间接ELISA法。将Dextran T40-OVA交联物用包被缓冲液稀释，包被于96孔板，100μl/孔，4℃过夜。用封闭液（10%正常人血清）封闭2h，每孔加入不同稀释度的血清100μl。同时设立阳性、阴性对照，37℃放置1h，用PBST洗涤液洗3次后,加羊抗兔酶标二抗，37℃放置1h，再用PBST洗3次，加入OPD底物溶液，37℃避光放置15min，加终止液（2M H2SO4 溶液）终止反应，OD490读取结果。
3 结果与分析
3.1 Dextran T40-BSA交联物的制备
在0-7d的制备过程中，取样进行SDS-PAGE电泳，糖染色和考马斯亮蓝R250染色，结果如图1所示，可见，反应1d后，BSA大量减少，交联物大量出现，条带非常明显。随着反应时间的增加，条带越来越深，说明共价结合反应不断发生，聚合程度不断增加，分子量越来越大，得到大量的交联物。而干热反应0d 时，未见交联物条带。
3.2 葡聚糖多抗的制备 将上述反应7天后的Dextran T40-BSA交联物与等量完全福氏佐剂混合并充分乳化，经背部皮内多点注射成年雄性新西兰白兔,每次抗原剂量为1000μg/只。2周后以等量不完全福氏佐剂进行第2次免疫,之后每隔2周加强免疫1次。经4次免疫后采血，采血前3d，耳静脉加强免疫1次，剂量为500μg/只。颈动脉插管采血,分离血清,即得到葡聚糖多抗血清，置-20℃保存。 3.3 血清效价测定
制备的葡聚糖多抗血清用ELISA法测定血清效价，以OD值P≥1.0的血清稀释度作为血清效价，因阴性对照的OD值N为0.051，此时P/N=20，远远大于经验值2.1，可判断抗体为阳性。由图2可见，血清抗体效价达1∶32000以上。
 图2 血清抗体效价测定
3.4 抗体的纯化
血清经 rProtein A纯化，收集各流出液进行SDS-PAGE电泳。经 rProtein A纯化后，在分子量为 55kD和 22kD处呈现两条带，分别相当于抗体的重链和轻链的分子量，证明血清经纯化可获得纯度较高的抗体，结果见图3。
 图3 兔IgG纯化SDS-PAGE
4 讨论
多抗制备的关键是免疫抗原的合成，Maillard反应干热交联法虽然制备周期长，但是产量高、纯度好，而且能较好保持葡聚糖的化学结构，有利于白兔对葡聚糖的免疫应激反应，产生葡聚糖抗体，故采用Maillard反应干热交联法。
目前抗体分离方法很多，主要有硫酸铵沉淀法，辛酸沉淀法，DEAE离子交换层析法，轻基磷灰石层析法，凝胶层析法，以及上述方法相结合的联合分离方法。同时还有Protein A亲和层析法，Protein G亲和层析法，抗原亲和层析法和抗抗体亲和层析法，在这些方法中，郭刚[6]认为，rProtein A是分离、纯化兔抗体的较好的方法之一。为了得到高效价、高纯度的抗体，我们采用Protein A纯化兔血清IgG。
本实验通过Maillard反应干热交联法成功制备了免疫原及检测原，通过免疫新西兰白兔，间接ELISA方法测定抗体滴度，常规方法分离血清，得到较高纯度的葡聚糖多抗。
参考文献
[1]D. F. Day, J. Cuddihy and J. Rauh。Versatility of the Antibody Dextran Test Method,Journal American Society of Sugarcane Technologists, Vol. 23, 2003
[2]戚 荣,梁达奉,陈海宁等.抗葡聚糖单克隆抗体制备研究[J].甘蔗糖业,2006,(3):40-42.
[3]Akio Kato ,Youko Sasaki ,Ritsuko Furuta ,et al。 Functional protein-polysaccharide conjugate prepared by controlled dry-heating of ovalbumin-dextran mixtures[J ] . Agric Biol Chem,1990 ,54 (1) :107–112.
[4]曹佐武.糖蛋白PAGE 分离后的糖基显色法[J].生物技术通报,2006,(5):87-89.
[5]邵 敏,李 明,潘小玫等.多克隆抗体制备、鉴定与应用[J].中国农业科学,2005,38(8):1570-1573.
[6]郭刚,郭善一,解用红.抗人载脂蛋白E多抗的制备和纯化[J].天津医科大学学报,1995,(3):1-3.
[7]Charlotta Bergquist, Teresa Lagergard, Marianne Lindblad, et al 。 Local and Systemic Antibody Responses to Dextran-Cholera Toxin B Subunit Conjugates. INFECTION AND IMMUNITY, May 1995, 2021–2025.
曾练强，男，高级工程师，从事化学、微生物学等方面的研究。 |
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