链霉菌基因组提取方法的比较与改进
2009-04-28 20:35:20   来源：发酵在线扫描   评论：0 点击：

链霉菌基因组提取方法的比较与改进

刘文斌,马立新,蒋思婧,江正兵(湖北大学生命科学学院,湖北武汉430062)

摘　要:将链霉菌菌株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.纯化后,测得其葡萄糖异构酶的比活力为0.414ｕ/ｍＬ,使用苯酚氯仿法抽提到的基因组ＤＮＡ浓度较低,ＲＮＡ和蛋白质较多,但用大量法时仍可得到大量的ＤＮＡ.使用试剂盒法得到的基因组ＤＮＡ浓度较大,但仍有大量ＲＮＡ存在.由亚精胺法得到的基因组ＤＮＡ浓度较好,ＲＮＡ很少.自行设计的改进法得到的基因组ＤＮＡ,量特别大,纯度很高,ＤＮＡ大小集中在30ｋｂ左右,ＲＮＡ很少,非常适用于相应的基因工程操作.

关键词:链霉菌;葡萄糖异构酶;基因组;酶活

中图分类号:Ｑ939.97　　

文献标识码:Ａ

糖类物质在自然界中分布广泛,存在于木材、植物块茎和果实等中,它们一般是葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖等单糖或其衍生物的聚合物,合理有效地开发这些自然界的糖资源,将会有可观的经济效益,这其中牵涉到许多微生物酶,如淀粉酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶以及葡萄糖异构酶等.20世纪五六十年代就已开始研究葡萄糖异构酶(Ｇｌｕｃｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ,又称木糖异构酶),已克隆了几种链霉菌的葡萄糖异构酶基因,并进行了序列测定[1～8].本实验旨在通过研究高温链霉菌,从而得到耐高温葡萄糖异构酶的基因,以便用于高果糖浆(Ｓｙｒｕｐ)的生产.本文论述了菌种的纯化、酶活测定及基因组ＤＮＡ的提取,这些都是以后基因克隆和测序的前提.1　材料和方法1.1　菌种　链霉菌97022菌种即Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.购自武汉大学典型菌种保藏中心,由云南省微生物研究所徐丽华分离.1.2　试剂及仪器　胰蛋白胨:ＵｎｉｐａｔｈＬｔｄ.,Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ,Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ,Ｅｎｇｌａｎｄ;酵母膏:ＯｘｏｉｄＬｔｄ.,Ｂａｓ ｉｎｇｓｔｏｋｅ,Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ,Ｅｎｇｌａｎｄ;琼脂粉:日本进口分装,武汉卫检科技开发服务公司;咔唑:Ｓｉｇｍａ公司;ＵＮＩＱ-10柱式基因组ＤＮＡ小量抽提试剂盒:加拿大ＮＳＢＣ和Ｓａｎｇｏｎ公司,上海生工生物工程有限公司.1.3　培养基　ＹＭ(ＹｅａｓｔＭａｌｔ)液体培养基:酵母膏3.0ｇ,麦芽汁3.0ｇ,胰蛋白胨5.0ｇ,蒸馏水1000ｍＬ,ｐＨ9.0;ＹＭ固体培养基:ＹＭ液体培养基加2%琼脂粉;葡萄糖异构酶诱导培养基:酵母膏3.0ｇ,胰蛋白胨5.0ｇ,葡萄糖10ｇ,蒸馏水1000ｍＬ,ｐＨ9.0;ＹＭＧ(ＹｅａｓｔＭａｌｔＧｌｕｃｏｓｅ)液体培养基:ＹＭ液体培养基加1%葡萄糖;ＹＭＧ固体培养基:ＹＭＧ液体培养基加2%琼脂粉.1.4　葡萄糖异构酶活力测定[9～10]　使用ＹＭ平板,55℃下培养,纯化链霉菌97022菌种.配制葡萄糖异构酶诱导培养基50ｍＬ,装于500ｍＬ三角锥瓶,接种链霉菌97022,50℃,200ｒ/ｍｉｎ培养48ｈ,根据文献[2]所述方法进行酶活测定,并选择蒸镏水、果糖、葡萄糖液、酶液作对照.1.5　基因组ＤＮＡ抽提1.5.1　方法一　依照文献[11]、[12]进行.1.5.2　方法二　使用ＵＮＩＱ-10柱式基因组ＤＮＡ小量抽提试剂盒提供的方法,50℃,200ｒ/ｍｉｎ,液体培养97022菌种24ｈ,8000ｒ/ｍｉｎ,离心10ｍｉｎ得菌丝体,使用灭菌的滤纸吸干菌丝上的液体,将400ｍｇ左右的细胞,置液氮(-196℃)中冷冻7～8ｍｉｎ后,在研钵中将菌丝碾碎得浆液,将100ｍｇ左右的浆液转移到1.5ｍＬ离心管中,加ｐＨ8.0的ＴＥ补足到200μＬ,充分悬浮浆液,加入400μＬＤｉｇｅｓｔｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎ,混匀,再加入3μＬＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ,混匀,55℃保温5～18ｈ,加入200μＬ无水乙醇,混匀,然后将样品全部转移到ＵＮＩＱ-10柱中(使用1ｍＬ加样Ｔｉｐ头),柱子又放入2.0ｍＬＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＴｕｂｅ中,用台式离心机,10000ｒ/ｍｉｎ室温下离心1ｍｉｎ,取下ＵＮＩＱ-10柱子,弃去离心管中的废液,将柱子放回同一离心管中,加入500μＬＷａｓｈＳｏｌｕｔｉｏｎ10000ｒ/ｍｉｎ室温下离心1ｍｉｎ,用500μＬＷａｓｈｓｏｌｕｔｉｏｎ重复洗一次,取下ＵＮＩＱ-10柱子,弃去离心管中的全部废液,将柱子放回同一根离心管中,10000ｒ/ｍｉｎ,室温下离心1ｍｉｎ,以除去残留的ＷａｓｈＳｏｌｕｔｉｏｎ,在柱子中央加入100μＬＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ,将柱子放入新的干净的1.5ｍＬ离心管中,室温下或37～55℃放置2～3ｍｉｎ,10000ｒ/ｍｉｎ室温下离心1ｍｉｎ,收集管中的液体即为基因组ＤＮＡ,样品可保存在4℃或-20℃.1.5.3　方法三[3]　前述步骤参考方法一,在用苯酚、氯仿抽提后,在上清液中加入0.25体积5ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ,混匀,再加入0.7倍体积的异丙醇,沉降基因组ＤＮＡ10ｍｉｎ以上,12000ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ,取沉淀,加入400μＬ10ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ8.0),混匀,加入400μＬ2.9ｍｍｏｌ/Ｌ亚精胺,沉淀ＤＮＡ15ｍｉｎ以上,12000ｒ/ｍ离心10ｍｉｎ(室温),取沉淀,加400μＬ异丙醇和400μＬ10ｍｍｏｌ/ＬＭｇＣｌ2,300ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ混合液,洗涤沉淀1ｈ,12000ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ,取沉淀,用0.5ｍＬ70%乙醇洗涤5ｍｉｎ以上,12000ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ,用70%乙醇再洗涤一次,取沉淀,去除干净70%乙醇,后将离心管在室温下阴干,用0.5ｍＬｐＨ8.0ＴＥ溶解基因组ＤＮＡ,后将ＤＮＡ保存于-20℃.1.5.4　改进法　链霉菌培养,溶菌酶、ＳＤＳ处理以及苯酚、氯仿抽提的方法同方法一,但其中不使用蛋白酶Ｋ和ＲＮａｓｅ,其后在ＤＮＡ溶液中加入0.25体积5ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ、200μＬ无水乙醇,以后的实验步骤同方法二,其中须将3份材料合并后上ＵＮＩＱ-10柱子.得到的基因组ＤＮＡ可以再参照方法三进一步提纯,以便除掉ＲＮＡ.2　结　果2.1　葡萄糖异构酶活力测定　测得发酵48小时的97022菌株产酶能力为0.414ｕ/ｍＬ.2.2　基因组ＤＮＡ抽提　由葡萄糖异构酶活力测定的结果可知,链霉菌97022菌株能够产生此酶,也就是说在基因组中有此酶基因,由方法一得到的基因组ＤＮＡ浓度较低,ＲＮＡ和蛋白质较多,如用大量法(即使用1ｇ菌丝体,40ｍＬ大离心管,其他试剂相应加倍)制备ＤＮＡ,则浓度较好,获得的ＤＮＡ量也很大,但ＲＮＡ和蛋白质仍然较多,在0.7%琼脂糖凝胶中电泳时,出现一条较亮的基因组ＤＮＡ主带,其前为大量的ＲＮＡ拖带.由方法二得到的基因组ＤＮＡ浓度较大,但在电泳时除了一条清晰的ＤＮＡ主带外,仍有一条较宽的ＲＮＡ前带,即方法二未能除去全部ＲＮＡ.由方法三得到的基因组ＤＮＡ浓度较好,ＲＮＡ很少,在电泳时几乎看不到ＲＮＡ带,由改进法得到的ＤＮＡ在电泳时,出现一条很亮很窄的基因组ＤＮＡ主带,没有拖带现象,ＲＮＡ也较少,ＤＮＡ的大小集中在30ｋｂ左右.

3　讨　论链霉菌97022可以在ｐＨ7.0或9.0的ＹＭ平板上生长良好,产生白色孢子及紫色可溶性色素,由此可见97022菌株是一种耐碱的高温链霉菌.我们所测得链霉菌97022的葡萄糖异构酶比活力是比较低的,仅为0.414ｕ/ｍＬ,可能是一种胞内酶.Ｗ.Ｐ.Ｃｈｅｎ测得Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｌａｖｏｇｒｉｓｅｕｓ的葡萄糖异构酶活力最高为2.74ｕ/ｍＬ[1].潘仁瑞测得的玫瑰栗色链霉菌(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｏｃａｓｔａｎｅｕｓ)的葡萄糖异构酶的活力高于180ｕ/ｍＬ[2].从文献可知不同的链霉菌菌种,使用不同的碳源、氮源和金属离子,产生葡萄糖异构酶的能力不同[1～5,8].本实验所测得的97022菌株的酶活是出发菌株即野生型原始菌株的酶活,经过基因工程改造或用其他方法诱变后一定会得到更高酶活的菌株.三种提取链霉菌基因组ＤＮＡ的方法各有千秋,方法一中的大量法可以使我们得到大量的ＤＮＡ,而用方法二得到的ＤＮＡ浓度较高,用方法三得到的ＤＮＡ则最纯.由改进法得到的基因组ＤＮＡ纯度很大,量也很大.这四种方法得到的基因组ＤＮＡ都可用于以后的部分酶切(Ｓａｕ3ＡⅠ)与载体ＤＮＡ(ＫＳ质粒)的连接反应,尤其是由改进法得到的ＤＮＡ,由于浓度大,因此在Ｓａｕ3ＡⅠ酶切后,用0.5%琼脂糖凝胶电泳、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ胶回收试剂盒抽提后,可以回收较多的ＤＮＡ酶切片段.改进法中没有使用蛋白酶Ｋ,因为没有必要,而且蛋白酶Ｋ较昂贵;也没有使用ＲＮａｓｅ,因为国产ＲＮａｓｅ往往不纯,混杂有难以灭活的ＤＮａｓｅ,经常会使正在抽提的基因组ＤＮＡ降解掉.所使用过的试剂盒中的ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ有质量问题或技术设计问题,因为用它洗脱得到的ＤＮＡ在-20℃下保存一定时间并融化后会有大量ＤＮＡ降解的现象,而用自己配制的ｐＨ8.0的ＴＥ洗脱得到的ＤＮＡ,在-20℃下可保存很长时间,至少半年以上.