氨甲酰妥布霉素高产菌株选育及其发酵特性研究
2009-06-01 18:23:35   来源：本站原创   评论：0 点击：

【摘要】 目的 筛选氨甲酰妥布霉素高产菌株并稳定其发酵效价。方法 以黑暗链霉菌Ts?228为出发菌株，经自然分离，UV诱变结合耐自身代谢产物处理，采用琼脂块法并结合摇瓶发酵来筛选高产菌，获得了Tt?49新菌株。以摇瓶发酵考察生长特性，罐上发酵绘制代谢曲线。结果 效价提高了1.8倍，妥布霉素含量高达68.5%。该菌株生长周期仅4d，传代稳定。种龄18h左右，接种量10%。按照代谢曲线图进行调控，发酵罐的产抗水平达5865u/ml。结论 自然分离与诱变相结合，是黑暗链霉菌选育的有效途径。出发菌株经UV诱变和耐受驯育，发酵效价显著提高。溶氧是妥布霉素发酵生产中的重要调控因子。

【关键词】 黑暗链霉菌； 氨甲酰妥布霉素； 深层发酵； 抗生素

氨甲酰妥布霉素(carbamoyltobramycin)是黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)经深层发酵产生的尼拉霉素复合物5′组分，经酸或碱催化水解得到妥布霉素(tobramycin)。妥布霉素是临床上广泛使用的第二代氨基糖苷类抗生素，主要作用于细菌30S核糖体亚基，抑制菌体蛋白质的合成，广泛应用于败血症、中枢神经感染及新生儿的脓毒症等［1］，总有效率达85%以上。妥布霉素与其它抗生素联合使用，不仅可增强抗菌活性，还可扩大抗菌范围。此外，妥布霉素对第八对脑神经的耳毒性比新霉素、庆大霉素低。由于发酵效价不稳定，分离纯化困难，生产成本居高不下，销售价格昂贵，影响其普及使用。

有关妥布霉素的研究活动一直很活跃，从生产菌株的改良到代谢途径的揭示，再到合成基因簇的克隆等各方面均有。沈阳药科大学采用紫外线和亚硝基胍结合耐受处理筛选妥布霉素产生菌［2，3］；丹麦科研人员利用碳标记实验考查代谢产物的通量，发现黑暗链霉菌在生长阶段ED途径活跃［4］，但未阐明安普霉素、卡那霉素B和妥布霉素的分歧代谢途径；韩国研究者于2004年从黑暗链霉菌ATCC17920中分离到妥布霉素生物合成基因簇［5］，有望给妥布霉素的生产带来质的飞跃，但阐明各个基因的功能并将其运用于工业化生产仍需一段过程。本文从菌种选育和工艺优化两方面进行研究，稳定并提高了妥布霉素工业化生产，取得了实效。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种 黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)Ts?228；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］，本实验室保藏菌。

培养基(%) ①斜面：葡萄糖3.0，蛋白胨0.5，氯化钾0.05，FeSO4·7H2O 0.001，磷酸氢二钾0.10，硫酸镁0.05，琼脂2.0，pH自然；②种子：葡萄糖0.5，玉米淀粉1.0，黄豆饼粉1.5，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾0.05，氯化钾0.1，CaCl2 0.025，pH自然；③发酵：葡萄糖1.5，玉米粉2.0，黄豆饼粉3.5，硫酸铵0.7，硫酸镁1.1，碳酸钙0.7，硫酸锌0.01，玉米淀粉2.0，豆油1.0，pH7.0～7.2。

仪器 生化培养箱(LRH?250A)；220r/min摇瓶机(自制)；15L种子罐和50L发酵罐(上海国强生化工程装备有限公司)；台式离心机(TGL16G)。

妥布霉素标准品和生测培养基：中国生物制品检定所。

1.2 分析方法

发酵效价采用生物检定法［6］；组分检测用薄板层析［6］和HPLC法［7］。菌丝浓度测定，取发酵液10ml，3000r/min离心10min，去上清液后的固体物作为相对菌丝浓度。其它项目(总糖、还原糖、氨基氮等)均采用工业化常规分析法［8］。

2 结果与讨论

2.1 自然分离

出发菌株黑暗链霉菌Ts?228主产尼拉霉素2，4和5′三个组分，菌落较大，孢子乳白，生测效价为3260u/ml。该菌株的单孢子悬液经自然分离获得白色和淡黄色两类菌落，琼脂块法检测菌落的抑菌效果。结果显示白色菌落抑菌活性高于淡黄色菌落，具备较好的生产潜力；淡黄色菌落在多次测定中抑菌活性均较低，参照文献［9］认为该菌落形态为退化株，不宜做出发菌。对白色菌落进行多次分离纯化，获得一比出发菌株提高8.27%，编号为Tn?17的高产菌株。

2.2 紫外诱变处理

取Tn?17菌株，制作单孢子悬液，分别在30W紫外灯下照射10、30、50、70和90s，然后分离单菌落，进行琼脂块初筛，摇瓶发酵复筛，结果见表1。

由表1可见，经紫外照射效价均有所提高。随着照射剂量的增加，死亡率渐次升高，正变率降低，负变率升高。其中50s为最宜剂量，致死率为85.1%，正变率为3.74%，负变率为15.1%，最高增幅为12.1%，此高产菌株编号为Tv?204。 表1 Tn?17紫外线照射时间与突变率的关系

2.3 耐自身代谢产物的分离筛选

依据高效价具有高抗性，高抗性不等于高效价的原则，利用抗自身代谢产物对抗生素产生菌进行选育是提高抗生素产量的有效手段。在培养基上加入不同剂量的妥布霉素，发现随着剂量的增大，菌株因进行适应调整，生长速度减慢，死亡率增大。Tv?204菌株在1000～4000u/ml的平板上均可生长，最宜剂量为3000u/ml，此时生长周期为5d，菌落形态无明显变异。经耐受处理获得效价提高11.5%的高产菌株，编号为Tt?49。

2.4 菌株Tt?49生长特性考察

(1)斜面优质孢子培养时间的确定 优质孢子的界定，用肉眼观察或显微镜观察都难以作出判断。界定优质孢子还是以斜面培养时间结合摇瓶发酵效价的方法，考察它们的相关性。为此设计了在其它条件相同的情况下，取不同培养时间的斜面进行摇瓶发酵，以发酵效价最高所对应的斜面培养时间作为界定斜面优质孢子培养时间的准则。经反复考察，斜面培养96h最好，结果见表2。

(2)传代对生产力稳定性的影响 菌株传代是否稳定是决定能否进入工业化生产的关键，为了考察所筛选菌株的传代稳定性，对Tt?49菌株连续传代，第1代斜面Fl，第2代斜面F2，第3代斜面F3，第10代斜面F10，分别进行摇瓶发酵。经测定，Tt?49菌株各子代发酵效价均落在4800～5300u/ml，波动较小，可以认为是稳定的。

(3)冷藏对稳定性的影响 为了考察冷藏对斜面孢子稳定性的影响， 将置于4℃冰箱保存不同时间的 表2 斜面孢子培养时间对效价的影响 由表3可见，斜面在冰箱保存7d内，对发酵效价影响不大；保存时间12d以上，不仅对种子
的菌丝形态(镜检)，而且对发酵效价均有明显的影响。因此建议采取低温干燥予以保存，生产斜面以新鲜为宜。

2.5 种子特性考察

(1)种龄的确定 种龄控制不当，影响菌种生产能力的发挥。移种过早，潜伏期较长，甚至长不起来，即使生长了也容易衰老；移种太晚，种子走向衰老，不利于发酵和合成抗生素。为此，考察了种子培养时间对发酵效价的影响，借此来确定合理的菌龄，结果见表4。

由表4可以看出，移种时间控制在16～20h，对效价无太大影响，总效价均在4800u/ml以上。18h(pH6.74，菌浓10%)移种，发酵效价最高，此时种子液颜色转黄，出现挂壁现象，镜检菌丝粗壮，分支多，染色深。当接种时间延长到24h时，种子菌丝开始变细、变长，空胞逐渐增多，发酵效价反而有所降低。由表4数据还可以看出，种子的菌丝浓度高不等于种子质量好，22h的种子浓度达12%，但最终发酵效价不高， 因此，表3 冷藏时间对生产力的影响 把握好合适的菌龄是把握好发酵的关键之一。

(2)接种量的确定 接种量的多少，决定了产生菌在发酵开始的生长繁殖速度和潜伏期的长短，同时也影响其最终产抗生素的水平，因此，确定菌龄之后，对接种量进行考察。将培养18h的种子按不同接种量(1%，3%，5%，8%，10%，15%)接入发酵瓶(40ml/250ml)，37℃，250r/min摇床培养110h，考察接种量对发酵效价的影响，结果显示接种量10%时发酵效价最高。

(3)溶氧对发酵效价的影响 溶解氧对妥布霉素发酵至关重要［10，11］。菌体在自身生长、繁殖及合成次级代谢产物的过程中都需要一定量的氧气。溶氧过低，影响菌体的生长和产物的合成，特别是影响糖的代谢；但过大的溶氧量导致菌丝疯长，对生产不利。妥布霉素发酵中黑暗链霉菌的生长是为了达到一定的菌密度，以便在分泌期有更多的菌体起作用，如果某些养分过于充足，造成菌丝疯长，在显微镜里观察到又粗又长的菌丝体，发酵液变得很稠，但妥布霉素的效价却很低。

发酵罐上可以通过调节搅拌转速或搅拌叶和空气流量来控制溶氧，摇瓶上则通过改变装料量和纱布层数来控制，以发酵效价为指标，确定溶氧条件。

本实验通过在250ml发酵瓶中改变发酵培养基装量来模拟发酵过程中提供不同的溶氧浓度，考察不同溶氧浓度对妥布霉素发酵效价的影响，结果见表5。

由表5的结果可以看出，摇瓶装量对发酵效价有一定的影响，其中以装量40ml效价最高。15ml/250ml的装料量供氧过多，菌丝疯长，大量底物消耗于生长，对次级代谢不利， 效价较低； 50ml/250ml的装料量供表4 种龄对效价的影响表5 不同装料量对效价的影响氧不足，菌生长受到限制，菌丝过早断裂，由于没有足够的菌密度，效价上升缓慢，底物消耗大，最终效价也低。此外，发现随着装量的增加，发酵终点的pH值呈逐渐下降的趋势，可能是溶氧过低，影响糖的有氧代谢，导致一系列酸性代谢产物的积累而使pH下降。

2.6 发酵代谢曲线

根据以上对工艺条件初步研究所取得的结果，进一步扩大到50L发酵罐进行验证，定时取样，测定各主要参数(pH、相对菌丝浓、效价，DO2、总糖、还原糖和氨基氮等)，绘制发酵代谢图(图1)。

由图1可以看出，高产菌Tt?49在妥布霉素发酵过程中pH先升后降再升，变化平缓。发酵前期(0～30h)，pH由自然升到7.5左右，此阶段为菌体快速生长期，大量利用碳源，总糖、还原糖急剧降低，菌浓不断升高；中期(30～90h)pH略有下降并维持在7.2左右，此时为生产期，不断消耗营养物质合成次级代谢产物，是提高效价的关键时期；90h后pH逐渐升高，此时菌体开始自溶，表现为pH开始上升，菌浓不断降低，碱性产物不断被分泌到胞外引起pH不断升高。

3 小结

紫外诱变结合耐受处理是筛选氨甲酰妥布霉素高产菌株的有效手段。本研究通过此获得比出发菌株增产180%的高产菌株Tt?49，发酵水平达5865u/ml。高产菌株Tt?49斜面生长周期4d，传代稳定，可冷藏7d，种龄18h，接种量10%。溶解氧对于黑暗链霉菌的深层发酵至关重要，发酵罐上可通过改变搅拌转速和改变通气量来改变溶氧浓度。

根据溶氧曲线，优化发酵工艺，获得一套较适合氨甲酰妥布霉素高产菌株Tt?49的代谢曲线特性图。按照该曲线特性图进行调控，可使抗生素生产水平接近于摇瓶的生产水平，充分发挥了菌株的抗生素生物合成潜力，达到了较为理想的效果。

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