水稻稻瘟病拮抗菌株C-18发酵条件的研究
2007-12-18 23:03:10   来源:食品与发酵工业   评论:0 点击:

摘要:本文对稻瘟病拮抗菌C-18的摇瓶发酵条件进行了初步研究,结果表明C-18菌株的适宜发酵培养基QH培养基,其适宜的摇瓶发酵条件是:初始pH7.5、摇瓶装液量50ml/250ml三角瓶、发酵温度32、发酵时间7.5d。发酵条件的正交试验结果表明,在其最适宜的发酵条件下,其相对抑菌率达87.1%。对C-18菌株发酵液的酸碱稳定性和热稳定性研究表明,该发酵液在弱酸、弱碱和中性环境中抑菌活性稳定,在极酸和极碱环境中活性易丧失,当pH=7.5时活性最高;在75环境中抑菌活性稳定,100环境中活性随时间的延长不断下降,说明发酵液的酸碱稳定性好,热稳定性不是很好。

关键词:稻瘟病;拮抗菌;发酵条件

在抗生素工业生产中,为了获得较大的收益,就必须通过最大程度的降低成本、提高产量来提高利润,发酵条件的研究正是实现这一目标的有效手段。由于时间和试验条件的限制,本试验选择对C-18菌株发酵液的培养基种类、初始pH值、温度、装液量以及培养时间这几方面进行单因素和正交试验的研究,还对发酵液的热稳定性和pH稳定性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种 

稻瘟病拮抗菌株C-18

病原菌:水稻稻瘟病病原菌由广西大学农学院植病教研室提供。

1.1.2主要仪器

SPX-250型生化培养箱、HVE-50自动灭菌锅、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵、RE-52A旋转蒸发器。

1.1.3培养基:

菌种保藏及试管斜面培养基:高氏一号固体培养基:参照文献[1]

马铃薯琼脂(PDA)培养基:参照文献[2]

液体发酵培养基:高氏一号液体培养基:参照文献[1]

1.2 方法[3]

1.2.1 液体种子的准备:取斜面保藏菌种接种入装有液体发酵培养基的三角瓶中,28160 r/min振荡培养2d

1.2.2发酵液拮抗性的测定[4]

接拮抗菌于高氏一号液体培养基中(100m1/250m1三角瓶)28 , 160r/min培养6d,真空抽滤,将菌体研磨后倒入滤液中,摇匀,8000r/min,离心25min,取上清液进行浓缩,再用细菌过滤器过滤,收集滤液。在PDA平板中央打一个d=15mm的孔,移取150u1滤液注入孔中,在距孔中央2.5cm处接生长旺盛的稻瘟病菌琼脂块进行拮抗性测定,以无菌空白培养基浓缩液作空白对照,重复三次,28下培养,当空白对照菌丝长满培养皿时,记录拮抗情况,测量菌落半径,并计算相对抑菌率。

相对抑菌率(%=(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100%

       或相对抑菌率(%=拮抗带宽度/对照菌落半径×100%

1.2.3 培养基对产抗生素量的影响

   供试培养基有十种[5-7](配方见表1),培养基均调pH7.2,装入250ml的三角瓶中,每瓶100ml,灭菌后,加入5ml培养好的液体种子,28160 r/min条件下振荡培养6d,测各发酵液对稻瘟病菌的拮抗性,测定方法同1.2.2

1 菌株发酵培养基配方(g/100ml)

培养基

成分

1

葡萄糖2.0 黄豆粉2.5 酵母粉0.4 淀粉1.0 牛肉膏0.005 NaCl 0.2

2

葡萄糖4.0 黄豆粉4.0 酵母粉0.4 硫酸铵0.3 NaCl 0.1 Na2HPO4 0.005

3

葡萄糖2.0 黄豆粉2.5 酵母粉0.4 淀粉1.0 牛肉膏0.1 NaCl 0.2 K2HPO4 0.005

4

葡萄糖2.0 黄豆粉1.5 酵母粉0.3 淀粉2.0 NaCl 0.2 CaCO3 0.5 K2HPO4 0.02

5

葡萄糖2.0 黄豆粉2.0 酵母粉0.1 淀粉1.0 玉米粉3.0 硫酸铵0.2 

 

硫酸镁0.03 NaCl 0.2 CaCO3 0.6 K2HPO4 0.02

6

葡萄糖3.0 黄豆粉3.0 酵母粉0.4 玉米粉3.0 硫酸铵0.4  硫酸镁0.04

ACSI

黄豆粉5.0 淀粉2.0 玉米粉2.0 NaCl 1.5

QH

黄豆粉2.0 淀粉5.0 NaCl 0.2 K2HPO4 0.1 CaCO3 0.5

高氏Ⅰ号

淀粉2.0 硫酸镁0.05 KNO3 0.1 K2HPO4 0.05 NaCl 0.05 FeSO4 0.001

PDA

葡萄糖2.0 马铃薯20

1.2.4  pH条件对产抗生素量的影响

250ml的三角瓶中装入100mlQH液体培养基,将培养基的初始pHHClNaOH调成3.04.05.06.07.08.09.0,灭菌后,加入5ml培养好的液体种子,28160 r/min条件下振荡培养6d,测各发酵液对稻瘟病菌的拮抗性,测定方法同1.2.2

1.2.5 温度对产抗生素量的影响

250ml的三角瓶中装入100mlpH8.0QH培养基,灭菌后,加入5ml培养好的液体种子,分别放在26283032343638160 r/min振荡培养6d,测各发酵液对稻瘟病菌的拮抗性,测定方法同1.2.2

1.2.6 装液量对产抗生素量的影响

250ml的三角瓶中装入pH8.0QH培养基25ml50ml75ml100ml150ml200ml,灭菌后,加入5%培养好的液体种子,32160 r/min振荡培养6d,测各发酵液对稻瘟病菌的拮抗性,测定方法同1.2.2

1.2.7 培养时间对产抗生素量的影响

250ml的三角瓶中装入50mlpH8.0QH液体培养基,灭菌后,加入5%培养好的液体种子,32160 r/min振荡培养4d4.5d5d5.5d6d6.5d7d7.5d8d8.5d9d,测各发酵液对稻瘟病菌的拮抗性,测定方法同1.2.2

1.2.8 正交组合试验

根据单因素试验的结果,选取pH、温度、装液量、培养时间四因素,pH7.58.08.5三水平,温度取303234三水平,装液量取25ml50ml75ml三水平,培养时间取7d7.5d8d三水平,因素水平及设计方案见表2,进行发酵培养,测定各发酵液对稻瘟病菌的拮抗性,选出一组最佳发酵条件,供发酵实验采用。

2   试验设计和实施方案表

,

因素

pH

 温度(℃)

通气量(ml)

时间(d)

实验1

7.5

30

25

7.0

实验2

7.5

32

50

7.5

实验3

7.5

34

75

8.0

实验4

8.0

30

25

7.5

实验5

8.0

32

50

8.0

实验6

8.0

34

75

7.0

实验7

8.5

30

50

7.0

实验8

8.5

32

75

7.5

实验9

8.5

34

25

8.0

实验10

7.5

30

75

8.0

实验11

7.5

32

25

7.0

实验12

7.5

34

50

7.5

实验13

8.0

30

50

8.0

实验14

8.0

32

75

7.0

实验15

8.0

34

25

7.5

实验16

8.5

30

75

7.5

实验17

8.5

32

25

8.0

实验18

8.5

34

50

7.0

1.2.9 发酵液的稳定性分析

1热稳定性试验

各取5ml发酵浓缩液,在75100水浴中加热,分别于10min30min60min后各取出1ml,自然冷却,还原至原始体积,以原始发酵浓缩液为对照,测定其对稻瘟病菌的抑菌活性,确定温度对农用抗生素生物活性的影响。

(2) pH稳定性试验

7份样品,每份6ml发酵浓缩液,用 1mol/LHCl1mol/LNaOH将样品分别调成pH135791113后,30水浴处理1h,再分别调节pH值回到7.0,测定各处理样品对稻瘟病菌的抑菌活性,确定pH对农用抗生素生物活性的影响。

2 结果与分析

2.1培养基对产抗生素量的影响

C-18菌株接种在不同培养基中,发酵培养6d后测发酵液对稻瘟病菌的抑菌情况,结果见图2。从图中可以看出,C-18菌株在QH培养基中发酵液的抑菌率最大,因而产生的抑菌物质可能也最多。说明本试验中QH培养基最适合C-18菌株产抗菌物质。

2.2 pH条件对产抗生素量的影响

C-18菌株接种于不同初始pHQH培养基中,发酵培养6d后测发酵液对稻瘟病菌的抑菌情况,结果见图3

从图中可知,当pH8.0时,相对抑菌率最高;在中性至弱酸弱碱性条件下,发酵液对稻瘟病菌的相对抑菌率仍较高,说明中性和弱酸弱碱性环境均适合C-18菌株产抗菌物质。

2.3 温度对产抗生素量的影响

C-18菌株接种于QH培养基中,在26283032343638下分别培养6d,取发酵液对稻瘟病菌进行抑菌测定,结果见图4

从图中可以看出,在选用的各种温度条件下,C-18菌株发酵液对稻瘟病菌均有抑菌活性,但在32时发酵液的活性最高,故选用32做为最适发酵温度。

2.4 装液量对产抗生素量的影响

250ml三角瓶中分别加入QH培养基25ml50ml75ml100ml150ml200ml,发酵培养6d后测发酵液对稻瘟病菌的抑菌情况,结果见图5

从图中可以看出,不同装液量对C-18菌株产抗生素具有不同的影响,随着供养量增加,抑菌率增大,在250ml三角瓶中加入培养基50ml时,发酵液的抑菌活性最大,抑菌率达82.5%,而装液量为25ml时,发酵液的抑菌率反而减小,可能是因为装液量过少,培养基粘在瓶壁上,真正用于菌体生长的营养成分不足,导致抑菌活性受影响。由此试验结果可以确定最佳的装液量为50ml

2.5 培养时间对产抗生素量的影响

C-18菌株接种于QH培养基中摇床发酵培养4d后,开始每隔12h测发酵液对稻瘟病菌的抑菌活性,结果见图6

从图中可以看出,培养时间对C-18菌株产抗生素有较大影响,培养4d时发酵液已具有抑菌活性,但活性不高。随着培养时间的延长抑菌活性逐渐提高,培养至7.5d时发酵液的抑菌活性达到最大,此后发酵液的抑菌活性有所下降。所以C-18产抗生素的最佳发酵时间为7.5d

2.6 正交组合试验结果

   根据以上单因素试验结果,取pH、温度、装液量、培养时间四因素和相应的三个水平值,按四因素三水平正交组合设计方案进行发酵培养,测发酵液的抑菌活性,结果见表3

通过试验可知发酵培养基的初始pH7.5、培养温度为32、装液量为50ml/250ml三角瓶、培养7.5dC-18菌株发酵培养的最佳条件,此培养条件下发酵液的抑菌活性最大,相对抑菌率达87.1%

3 四因素三水平正交组合试验结果

实验方案

处理菌落半径

对照半径

拮抗带

相对抑菌率

(mm)

(mm)

(mm)

(%)

实验1pH7.5,30,25ml,7.0d

2.9

17.0

14.1

82.9

实验2pH7.5,32,50ml,7.5d

2.2

17.0

14.8

87.1

实验3pH7.5,34,75ml,8.0d

2.7

17.0

14.3

84.1

实验4pH8.0,30,25ml,7.5d

3.2

17.0

13.8

81.2

实验5pH8.0,32,50ml,8.0d

2.8

17.0

14.2

83.5

实验6pH8.0,34,75ml,7.0d

3.6

17.0

13.4

78.8

实验7pH8.5,30,50ml,7.0d

4.6

17.0

12.4

72.9

实验8pH8.5,32,75ml,7.5d

4.3

17.0

12.7

74.7

实验9pH8.5,34,25ml,8.0d

4.2

17.0

12.8

75.3

实验10pH7.5,30,75ml,8.0d

2.4

17.0

14.6

85.9

实验11pH7.5,32,25ml,7.0d

2.6

17.0

14.4

84.7

实验12pH7.5,34,50ml,7.5d

2.5

17.0

14.5

85.3

实验13pH8.0,30,50ml,8.0d

3.0

17.0

14.0

82.4

实验14pH8.0,32,75ml,7.0d

3.4

17.0

13.6

80.0

实验15PH8.0,34,25ml,7.5d

3.3

17.0

13.7

80.6

实验16pH8.5,30,75ml,7.5d

4.5

17.0

12.5

73.5

实验17pH8.5,32,25ml,8.0d

4.0

17.0

13.0

76.5

实验18pH8.5,34,50ml,7.0d

4.8

17.0

12.2

71.8

 

2.7 发酵液稳定性分析结果

2.7.1 热稳定性试验结果

将原始发酵浓缩液在75100水浴中分别加热103060min后,检测发酵液的抑菌活性,结果见图9。从图中可以看出,发酵液在75温度下稳定,抑菌活性与对照差不大;在100温度下随着时间的延长抑菌活性不断下降,当处理时间为60min时抑菌活性基本丧失,说明C-18菌株发酵液的热稳定性不是很好,随着温度的升高活性变化较大。

 

2.7.2 pH稳定性试验结果

在相同测试条件下,将各处理发酵液分别进行抑菌活性测定,结果见图10

从图中可以看出,在极酸和极碱(pH值小于3、大于11)条件下,发酵液的抑菌活性下降;而在中性和酸碱条件下(3<pH<11),抑菌活性都很稳定,与对照相差不大,说明发酵液的酸碱稳定性较好。

3 讨论

一般工业发酵工艺的研究分为三个阶段,实验室阶段、中试工厂规模、工厂生产规模。生产中广泛采用摇瓶试验进行初步考察,再逐步转移到工厂生产中去,即新工艺的放大,摇瓶试验的结果为罐发酵试验提供一些可供参考的数据,具有一定的指导意义,但摇瓶发酵放大到发酵罐发酵时往往两者结果并不一致。本试验的结果是在实验室进行的,真正应用到生产上还要进一步中试放大,进而进行大规模的生产[8]

致谢 广西大学生命科学与技术学院陈山岭和管立忠等同学在实验过程中给予了很多帮助,特此致谢。

参考文献

[1]中国科学院微生物研究所放线菌分类组.链霉菌鉴定手册.北京:科学出版社,1975658

[2]祖若夫,胡宝龙,周德庆.微生物学实验教程[M].上海:复旦大学出版社,1993:177-180

[3]中国医药工业总公司,抗生素工业生产编写组. 抗生素工业生产(上、下册);1986

[4] 张宇, 张敏, 叶亚军. 稻瘟病生防放线菌菌株A11发酵液中抗菌物质的稳定性测定[J]. 中国农学通报. 2005, 21(6):315-316.

[5]孟庆芳,张汀,杨文香. 拮抗链霉菌S23发酵条件的研究.中国生物防治,2002,18(2):79-82

[6]何红,沈兆昌,邱思鑫.内生拮抗枯草芽孢杆菌BS22菌株的发酵条件.中国生物防治,2004,20(1):38-41

[7]韩斯琴,徐梅,白震.番茄灰霉病菌拮抗菌D2-4发酵条件的研究.东北农业大学学报,2004,35(1):93-98

[8]张嗣良,梁学贤. 我国生物及制药过程控制与装备技术的发展趋势与今后发展设想. 医药工程设计杂志, 2002231):3-4 

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