小多孢菌次级代谢产物的研究
2007-12-07 22:47:55   来源：本站原创   评论：0 点击：

　　自从20世纪40年代Waksman从放线菌中发现链霉素以来,从放线菌中开发抗生素的的研究从未间断,并在20世纪五六十年代达到高潮,为人类的医疗保健事业作出了巨大的贡献[1]。现在许多专家认为,并非存在于自然界的所有类型的抗生素均已被发现,如果研究异常生活环境下的稀有微生物,找到新化学结构的微生物的机会将更大。基于这种思想,笔者对从陕西省靖边县沙漠中分离到的一株小多孢菌进行了初步研究。该菌株经液体摇瓶发酵后,对其发酵液化学成分进行分离与鉴定,得到2个化合物:17-demethyl-lebrasta-tin (1);4,6-二甲氧基-3-(3,5-二甲氧基苯基)-2-(4-甲氧基苯基)-1-氢-茚-1-酮(2)。其中,化合物1是新化合物。
1　材　料
1·1　仪　器
XRC-1型显微熔点仪(温度未校正);Pekin-Elmer 983G型红外光谱仪(KBr压片);Bruck-500型核磁共振仪(TMS内标);MAT-711型质谱仪;VarioEL元素分析仪;分析型HPLC (Waters 515-2996);Amberlite XAD-16型大孔吸附树脂;Sephadex LH-20(美国Pharmacia公司);色普柱层析硅胶(200~300目)青岛海洋化工厂产品。
1·2　材　料
种子培养基　酵母浸膏4 g ,葡萄糖4 g ,麦芽浸膏4 g ,蛋白胨3 g ,维生素B11 mg ,维生素B61 mg,苯丙氨酸1mg,CaCO34 g,水1 000 mL, pH6·8。

　　发酵培养基　大豆粉20 g ,蛋白胨2 g ,葡萄糖20 g ,淀粉5 g ,酵母膏2 g ,NaCl 4 g ,K2HPO40·5 g,MgSO4·7H2O 0·5 g ,CaCO32 g ,水1 000 mL,pH6·8,28℃,培养96 h。
2　提取与分离
将发酵96 h的发酵液以3 000 r/min离心,得上清液,将上清液40 L过装有Amberlite XAD-16型大孔吸附树脂的固相萃取柱,然后用甲醇洗脱吸附在大孔吸附树脂上的次级代谢产物。将甲醇洗脱液蒸干,获得粗样品58 g ,粗样品用水100 mL溶解,溶解部分再用乙酸乙酯2·0 L分4次萃取。合并乙酸乙酯萃取液,减压浓缩至浆状物。加氯仿和
甲醇溶解,拌硅胶(200~300目)、晾干,上硅胶柱分离,用氯仿-丙酮系统梯度洗脱,比例为5∶1,4∶1,2∶1,分段集,TLC检测,TLC展开系统为氯仿-甲醇(9∶1),紫外和碘熏显色,合并两个黄色主斑点,得粗样品A:210 mg,B:468 mg。样品A和B继续上Sephadex LH-20凝胶柱,丙酮洗脱,各流分以HPLC检测,相同组分合并,从A中分离得到化合物1(84 mg);从B中分离得到化合物2(301 mg)。
3　结构鉴定
化合物1　无色针状结晶,mp:248~250℃,λmax:218 nm,288 nm。IR(KBr,cm-1) 3 382,2 948,2 365,1 768,1 658,1 608,1 383,1 109,1 058,990。ESI(+)-MS显示准分子离子峰m/z535[M+H]和557[M+Na];元素分析得知碳、氢、氮的百分含量(%)分别为62·80,7·86和5·20;质谱和元素分析提示该化合物的分子式为C28H42N2O8,分子中有9个不饱和度。1H和13C NMR显示了分子中有6个甲基,4个亚甲基,10个次甲基,和8个季碳(表1)。通过二维核磁共振相关谱,将所有质子和碳的化学位移进行了归属(表1)。在H-H COSY谱(表1)上,观察到了H-7(δ:4·91,d,J=7·8 Hz)与H-6 (δ:3·30,dt,J=7·8,6·4 Hz);H-11 (δ:3·50,dd,J=7·4,6·8 Hz)与H-12 (δ:3·08 ,dt,J=6·8,6·4 Hz)的相关信号。在HMBC相关谱(表1)中,H-1(δ:8·57)与C-2(δ:135·9)、C-19(δ:109·6)、C-21(δ:116·3)有相关,2-CH3(δ:1·79)与C-1(δ:175·2)、C-3(δ:137·2)相关,6-OCH3(δ:3·34)与C-6(δ:81·6)相关,12-OCH3(δ:343)与C-12(δ:83·2)相关。该化合物的其余H→C见表1。综合以上分析以及文献检索,发现该化合物与文献报道的Lebrastatin结构类似[2],但相对分子质量相差14,此外在HMBC相关谱中,没有观察到与C-17相关的甲氧基信号,故
推定化合物1的结构为17-demethyl-lebrastatin。该化合物尚未见文献报道,故为一新化合物(图1)。化合物2　红色针状结晶(丙酮),mp:157~158℃;ESI(+)-MS:m/z433[M+H]+,455[M+Na]+,提示该化合物的相对分子质量为432,元素分析知该化合物的碳、氢的百分含量(%)分别为72·35、5·54,故确定分子式为C26H24O6,不饱和度为15。红外光谱显示了该化合物在3 031·3 cm-1(苯环C-H伸缩振动)、1 676·5 cm-1(C=O)、1 604·0、1 503·8 cm-1(苯环骨架振动)、1 057·6 cm-1(C-O伸缩振动)吸收峰;1H NMR (500 MHz,CDCl3)δ:
6·58 (s,1H),6·88 (s,1H),6·49 (s,2H),6·15 (s,1H),7·16 (d,J=8·9 Hz,2H),6·76 (d,J=8·9 Hz,
2H),3·60 (s,3H),3·74 (s,3H),3·69 (s,6H),3·88(s,3H);13C NMR (125 MHz,CDCl3)δ:196·8,162·5,161·2, 158·6, 156·9, 154·3, 136·9, 134·2, 129·2,127·1, 125·2, 11·2, 108·1, 105·4, 104·1, 100·9,55·8,55·6,55·3,55·1·以上数据与文献[3]报道的数据基本一致,故化合物2鉴定为4,6-二甲氧基-3-(3,5-二甲氧基苯基)-2-(4-甲氧基苯基)-1-氢-茚-1-酮(图1)。

4　讨　论
从小多孢菌的次级代谢产物中分离得到的两个化合物,虽然尚未进行活性实验,但有文献报道化合物1的结构类似物具有一定的抗肿瘤活性[4]。新结构的化合物可能会有令人感兴趣的生物活性[5],对化合物1的生物活性研究有待进一步进行。