大肠杆菌发酵生产重组人颗粒溶素
2007-10-26 19:33:28   来源：江苏大学   评论：0 点击：

颗粒溶素(granulysin，GNLY)是存在于人类细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK cells)胞浆颗粒中的细胞毒性蛋白【l_ ，具有广谱抗菌活性【引。在机体免疫应答过程中，GNLY与穿孔素和颗粒酶等颗粒成分一起排出胞外，参与抗菌、抗病毒、抗寄生虫及杀伤肿瘤细胞等免疫过程M 。迄今，GNLY是细胞毒颗粒中惟一能直接杀伤细菌的免疫效应分子， 因此GNLY具有潜在的药用价值。近年来国外虽然有少数实验室将GNLY基因克隆到原核表达系统中，得到重组人GNLY，但尚未见有关工程菌发酵条件优化的报道。本实验室在国内首次获得了有生物活性的重组GNLY蛋白，并在此基础上对其工程菌的发酵条件进行了优化，为进一步研究GNLY的作用机制和临床应用打下基础。

1 材料与方法
1．1 材料
大肠杆菌BL21(DE3)plysS为本科保存株；重组质粒pET28a(+)一GNLY由本实验室构建。
试管种子培养采用LB培养基(蛋白胨10 g／L，酵母粉5 g／L，NaC1 10 g／L)， 二级种子培养采用2xYT培养基(蛋白胨16g／L，酵母粉10 g／L，NaC1 5 g／L)。发酵罐基础培养基为半合成培养基[蛋白胨10 g／L，酵母粉10 g／L，KH2PO 2 g／IJ，K2HPO4 g／IJ，Na2HPO~·12H20 7 g／L，(N}{4)2SO4 1．2 g／L，NH4C1 0-2 g／L，MnSO4·5H20 0．001 g／IJ，CoC12·6H20 0．004 g／IJ，Na2MoO4’2H20 0．002 g／IJ，ZnC12 0．002 g／L，CuSO4·5H20 0．001 g／IJ，H3BO4 0．005 g／IJ，FeSO4·7H20 0．02 g／IJ，CaC12’2H20 0．02 g／IJ，MgSO ·7H20 0．3 g／L，去泡剂0-2 mL／L]。补料培养基(甘油160 g／L，酵母粉65 g／L，蛋白胨65 g／L，MgS04’7H20 5．7 g／L)。各培养基均为pH7．0，并加入卡那霉素至终浓度25 I~g／mL。
蛋白胨，酵母粉均为OXIOD公司产品；层析纯化His-BindResin为Novagen公司产品。
FUS一50L生物反应器(上海国强生化工程装备有限公司)含pH 控制器、溶氧控制器、温度控制器、搅拌控制器、空气混合器及补料进样系统等。
1-2 细菌培养
待基础培养基组分(蛋白胨、酵母粉)溶解后，加入发酵罐，121oC灭菌30 rain。冷却后加入经同样条件灭菌的KH2P04、K2HP04、Na2HP04·12H20、(NH )2SO 、NH C1、微量元素溶液和去泡剂及卡那霉素。待补料培养基组分(蛋白胨和酵母粉)溶解后，121oC灭菌30 rain，与经同样条件灭菌的甘油和MgS0 ·7H20冷却后混合并加入卡那霉素。培养基各溶液在灭菌前都用NaOH调节到适当的pH值。将构建的重组质粒转化宿主菌BL21(DE3)plysS，挑取单克隆接种于LB液体培养基中，37oC、250 r／rain振荡过夜，作为活化的一级种子。取一级种子液， 以5％的接种量转接于含100mL 2xYT培养基的50o mL摇瓶中，37oC、250 r／rain振荡5 h，作为接人发酵罐的二级种液。按发酵罐工作体积的5％接人二级种子液，接种后发酵液体积为30 L。发酵培养分3阶段进行，起始4 h为细菌在基础培养基中生长，4 h后开始加入补料，继续生长6 h后开始进入第3个阶段，加入葡萄糖，温度降至30℃ ，在继续补料的情况下诱导表达。在诱导后1-6 h内间隔1 h取样测表达率；根据溶氧变化反馈补料，在整个发酵过程中，要根据pH值变化补加30％的氨水，维持培养体系pH值为6．5～7．0；调控搅拌速度及空气流量，使溶氧不低于30％，必要时通纯氧。
1．3 细菌生长情况监测
在发酵过程中每0．5 h测定1次菌液浓度(D‰ 值)；发酵结束后，将发酵菌液以5 000 r／rain于4℃离心30 rain，PBS重悬菌体2次，称量菌体湿重。
1．4 表达上清中可溶性GNLY的纯化
加入10倍体积的lxPBS，置冰浴中以30o～400 W 超声裂解15次，每次10 s，间隔10 s，重复1次。离心取上清，用Novagen公司的His—Bind Resin以亲和层析法纯化GNLY融合蛋白，以不同浓度的咪唑平衡洗脱GNLY。
1．5 GNLY融合蛋白最佳诱导时间的筛选
取诱导表达1、2、3、4、5、6 h及过夜菌各1 mL，用SDSPAGE检测比较不同诱导时间所得GNIJY蛋白的量，筛选最佳诱导时间。
1．6 重组蛋白表达量的测定
取纯化所用蛋白及变性裂解所得到的细菌总蛋白，按一定稀释度用Beckman DU640微量核酸蛋白检测仪测定D 值，初步估算其纯度及浓度，计算表达率。比较发酵罐、摇瓶以及诱导1-6 h内的蛋白表达量。
1．7 Western 印迹验证重组蛋白的抗原活性
重组蛋白经SDS—PAGE后进行转印，将转印后的NC膜剪成条带，用含5％脱脂奶粉、0．02％ Tween一20的PBS封闭过夜。依次加入兔抗6一His多抗、羊抗兔IgG抗体、3，3一二氧联苯胺底物，检测重组蛋白的抗原性。
1．8 融合蛋白生物活性的检测
取大肠杆菌和不同浓度的GNLY共50 L于37℃共孵育3h，样品被稀释扩散于胰酶解酪蛋白琼脂，24 h后检测CFU数。
2 结果
2．1 补料培养细菌生长情况
在50L发酵罐中，我们分别在细菌生长到第8、9、10、11、12、13 h时开始诱导表达，发现在第8、9 h开始诱导表达时细菌最终密度较小( 值分别为17和19．5)，第11 h开始诱导时细菌最终密度已达最大(D 值为22．6)，继续延长开始诱导的时间到第13 h，菌体最终密度变化不大，说明在第11 h已经到达细菌生长的平台期。对发酵总时间、补料开始时间、诱导时机及诱导时间进行优化后，发现本方法培养17 h菌体密度最大可达到D 值为22．6，相当于80 g／L细菌湿重。
当细菌生长4 h后，溶氧下降速度明显减慢，表明培养基中营养物质已被消耗，细菌生长速度开始下降，故耗氧减少，应该开始补料。补料流速应控制在一定范围内，至11 h达最大，为9．8 mL／min，为维持pH值为6．5～7．1、溶氧30％ 以上，在第7 h开始补加30％的氨水，转速从第1 h的250 r／rain随着时间依次递增至最后为680 r／rain。在发酵过程中菌体密度、溶氧、补料流速、转速、pH值和温度的变化见图1～图6。
2．2 GNLY融合蛋白表达最佳诱导时间的确定
重组原核表达质粒pET28a (+)一GNLY在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中经IPTG诱导表达，1～2 h时蛋白表达量逐渐增加，4～5 h时蛋白表达量达到最大；培养时间再延长，蛋白表达量无明显变化；诱导过夜，蛋白表达量反而降低。见图7。
2．3 可溶性GNLY的表达及纯化
发酵结束后将收获的细菌反复超声15次以后，离心取上清，用亲和层析法纯化。经扫描显示，纯化所得的GNLY融合蛋白占细菌总蛋白的5％。12％ SDS—PAGE显示在相对分子质量为9 000处有明显的蛋白条带。经该法纯化后的蛋白纯度可达95％以上。见图8。
2．4 蛋白表达率的计算
利用His—Bind Resin亲和层析纯化上清中的GNLY，用核酸及蛋白分析仪测定其D～ 值，计算所纯化蛋白的纯度及浓度，最终得到蛋白得率为0．63 mg／g湿菌，故发酵后所获可溶性蛋白量为60 m 菌液。用同样方法测定未纯化前细菌的总蛋白，计算出可溶性GNIJY约占菌体总蛋白的5％，包涵体中融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的65％。比较发酵罐培养诱导表达1-6 b后蛋白的表达率，发现诱导后1～3 h为高表达期，诱导后5-6 h表达蛋白变化不大且已达到最大表达量(图9)。
2．5 GNLY融合蛋白的免疫学活性测定
亲和层析后将含GNLY融合蛋白的洗脱组分进行SDS—PAGE，再行免疫印迹检测，结果表明在相对分子质量9 000处有明显的抗原抗体反应(图10)。