冻融对发酵用大肠杆菌甘油保存的影响
2007-07-05 23:04:01   来源：中国生化药物杂志   评论：0 点击：

The Influence of Freezeing and Melting on the Storage of E.coli Strain in Glycerin Solution

Shi Yanli　Xu Dong　Ding Jie
（Shandong Jintai Biological Engineering Co.　Jinan 250100）

　　微生物菌种的保存方法因微生物种类不同而有所不同，国内外对此有较多的报道^［1～3］。甘油保存法是生产中常用的方法之一。在甘油保存菌种过程中，细胞内外形成的冰晶会对细胞造成结构上的损伤，从而影响菌种的存活率。本文主要探讨了反复冻融对发酵用大肠杆菌甘油保存的影响。为制药和微生物工作者提供具有参考价值的数据。

1　材　料

　　大肠杆菌PJLA605-HIL2。
　　LB固体培养基：胰蛋白胨(英国Oxoid)10 g、酵母抽提物(英国 Oxoid)5 g，氯化钠10 g，溶解并定容至1 000 ml，调pH至7.2，固体培养基加2%琼脂。

2　方法和结果

2.1　大肠杆菌培养
　　将待分离的菌种划LB平板，以取得单菌落，经模拟发酵选出优良菌种，将此菌种接到LB斜面上，30℃，培养24 h。
2.2　大肠杆菌冻存
　　用10%甘油溶液洗下培养好的菌种，并在无菌小烧杯中混匀，制成浓度为1×10⁸个/ml的菌悬液，然后分装到eppendorf管中，每支eppendorf管加菌液1 ml，将此菌种分成3组，编号1、2、3，然后放入-20℃冰箱中保存。
2.3　二次冻存
　　将2.2项中的第2、3组菌种从-20℃冰箱中取出，于28℃～30℃的水浴锅中融化，然后再放入-20℃冰箱冻存。
2.4　三次冻存
　　将2.3项中的第3组菌种从-20℃冰箱中取出，于28℃～30℃的水浴锅中融化，然后再放入-20℃冰箱冻存。
2.5　存活率的测定
　　采用平板菌落计数法。取LB平板9套，每3套为一组，在每组皿底分别标明10^-7、10^-8、10^-9，再取9个2 ml西林瓶，依次标明10^-1、10^-2、10^-3……10^-9，并向西林瓶中各加入无菌水0.9 ml。
　　用微量取样器精确吸取第1组菌液0.1 ml注入10^-1西林瓶中。将10^-1西林瓶内的菌液混匀，即成10^-1稀释液。再从10^-1西林瓶中取稀释液0.1 ml注入10^-2西林瓶中，重复上述操作，直至制成10^-7、10^-8、10^-9稀释液。
　　分别精确取10^-7、10^-8、10^-9稀释液0.1 ml注入对应的LB平板内，用玻璃涂布器涂布均匀，于30℃培养24 h后，数各皿中的菌落数，计算出同一稀释度3个平皿上菌落的平均数，根据菌落数计数活菌数。
　　用同样步骤可计算出冷冻前3组菌液的活菌数，见表1。
　　在冷冻后及冷冻后1年、2年分别将3组菌种从-20℃冰箱中取出，于28℃～30℃水浴锅中融化，用平板计数法测定活菌数，计算菌种存活率，如表1。

表1　冻融处理后菌体存活率(%)

　　在冷冻保存菌种时加入甘油作保护剂，虽然可以提高菌种的存活率，但冻融还是会造成菌体结构上的损伤。菌种每冻融一次，其存活率都会明显下降，经处理后的菌种保存1年或2年后，冻融次数越多，其存活率越低。因此，为使菌种有较高的存活率，不宜反复冻融。生产用甘油菌种一般保存1年，对1年后的菌种就要对其筛选活化后再用。

作者单位：石艳丽（山东金泰生物工程公司　济南，250100）
徐东（山东省药品检验所）
丁洁（山东省医药工业研究所）

参考文献

1，王亚珍.乳酸杆菌的保藏方法.生物技术，1998，8(1)∶41～42
2，李广武，郑从义，唐兵.低温生物学.长沙∶湖南科学技术出版社，1998∶130～131
3，中国科学院微生物研究所菌种保藏手册编著组.菌种保藏手册.北京∶科学出版社，1980∶649～652