生产β胡萝卜素大肠杆菌工程菌的构建yh
2007-04-15 09:35:44   来源：药　物　生　物　技　术   评论：0 点击：

　　β胡萝卜素是类胡萝卜素家族中的典型代表,分子式为Ｃ40Ｈ56,相对分子质量536.85。β胡萝卜素为一种着色性能良好的天然色素,也是维生素Ａ的前体物质,是一种有效的生理抗氧化剂,具有清除自由基的能力。β胡萝卜素作为食品添加剂、着色剂和营养增补剂,在防治癌症、提高机体免疫力和治疗心血管病等方面有特殊的作用,它还具有抗尼古丁和光保护作用,作为饲料添加剂使用具有一定的特异功能[1～6]。目前,β胡萝卜素被广泛应用于医药、保健品、食品、化妆品及饲料添加剂等领域。噬夏孢欧文氏菌是一种植物病原菌,其玉米黄素二糖苷合成途径是最早被阐明的类胡萝卜素合成途径之一,参与代谢的多个相关酶的编码基因也被克隆,其中ｃｒｔＥ基因编码ＧＧＰＰ合成酶,ｃｒｔＢ编码八氢番茄红素合成酶,ｃｒｔＩ编码八氢番茄红素脱氢酶,ｃｒｔＹ基因编码番茄红素β环化酶。Ｒｕｔｈｅｒ等[7]利用载体ｐＡＣＹＣ184建立起携带欧文氏菌类胡萝卜素合成基因的质粒:ｐＡＣＣＡＲ16△ｃｒｔＸ(载有ｃｒｔＥ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＹ)转入ＪＭ1Ｏ1大肠杆菌转化体系后生产出200～500μｇ/ｇ·ＤＷ的β胡萝卜素。Ｍｉｕｒａ等[8]利用假丝酵母Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ本身的启动子也在假丝酵母Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ中表达了噬夏孢欧文氏菌的ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ四个基因,酵母细胞累积β胡萝卜素,含量达0.4ｍｇ/ｇ·ＤＷ。本研究从Ｅｒｗｉｎｉａｕｒｅｄｏｖｏｒａ中克隆出β胡萝卜素合成的相关基因ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ,并将基因ｃｒｔＥＢＩ和ｃｒｔＹ分别置于强启动子Ｔ7的控制之下,构建了两个重组质粒,两重组质粒共转化大肠杆菌,获得了稳定高效生产β胡萝卜素的工程菌,以期为通过发酵大规模工业化生产提供依据。

1　材料与方法

1.1　材料

噬夏孢欧文氏菌Ｅｒｗｉｎｉａｕｒｅｄｏｖｏｒａ20Ｄ3(ＡＴＣＣ19321)购自美国模式菌种收集中心(ＡＴＣＣ),Ｅ.ｃｏｌｉＤＨ5α、Ｅ.ｃｏｌｉＢＬ21(ＤＥ3)、ｐＥＴ15ｂ购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司,ＵＮＩＱ10柱式ＤＮＡ胶回收试剂盒、ＵＮＩＱ10柱式质粒小量抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术有限公司,引物合成在上海生工生物工程技术有限公司完成,克隆所需工具酶购自宝生物(大连)工程公司,ｐＧＥＭＴ载体为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品,ｐＡＣＹＣ184载体、ｐＭＤ18Ｔ载体购自ＴａＫａＲａ公司,表达载体ｐＥＴ15ｂ购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司。β胡萝卜素、番茄红素标准品和ＩＰＴＧ(异丙基硫代βＤ半乳糖苷)为Ｓｉｇｍａ公司产品,其他试剂均为国产分析纯或色谱纯。

1.2　噬夏孢欧文氏菌基因组ＤＮＡ的制备主要参照Ｍａｓａｗａ等(1990)的方法。接种噬夏孢欧文氏菌单菌落于20ｍｌＬＢ液体培养基中,28℃培养过夜;取1ｍｌ菌液10000ｒ/ｍｉｎ离心1ｍｉｎ,沉淀用500μｌＧＥＴ缓冲液(50ｍｍｏｌ/Ｌ葡萄糖、10ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ、25ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓＣｌｐＨ8.0)悬浮均匀后,加入10μｌ溶菌酶(4ｍｇ/ｍｌ),37℃放置30ｍｉｎ;加入10%的ＳＤＳ至终浓度为1%,混匀至溶液透明,加入等体积饱和酚抽提1次,4℃下12000ｒ/ｍｉｎ离心15ｍｉｎ,取上清;在上清中加入等体积氯仿抽提1次,4℃下12000ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ,取上清;在上清中加入1/10体积的醋酸钠(0.5ｍｏｌ/Ｌ),等体积的异丙醇,混匀,12000ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ;沉淀用70%乙醇漂洗,挥干乙醇后,加入40μｌ的无菌水溶解。

1.3　重组质粒的构建根据已发表的基因序列(ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＤ90087)设计两对引物:引物1:5’ＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣ3’引物2:5’ＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣＴＧＡＣＧＧＣＡＧ3’引物3:5’ＡＣＴＣＧＡＧＴＡＡＡＧＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＴＧ3’引物4:5’ＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＧＡＣＡＴＧＧＣＧＣＴＡＧＡＧ3’引物5:5’ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＣＣＧＣＡＴＴＡＴＧＡＴＣ3’引物6:5’ＧＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＧＴＣ3’

以噬夏孢欧文氏菌基因组ＤＮＡ为模板,用引物1、引物2扩增ｃｒｔＥ基因,用引物3、引物4扩增含有自身核糖体结合位点的ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ的串联基因,用引物5、引物6扩增ｃｒｔＹ基因。将上述基因(ｃｒｔＥ、ｃｒｔＩ及ｃｒｔＢ)的ＰＣＲ产物分别克隆到ｐＧＥＭＴ载体上,ｃｒｔＹ基因ＰＣＲ产物克隆到ｐＭＤ18Ｔ载体上,测序正确后,用ＮｄｅＩ和ＸｈｏＩ切下ｃｒｔＥ基因,克隆到经同样酶切的ｐＥＴ15ｂ上构建ｐＥＴ15ｂｃｒｔＥ;用ＸｈｏＩ切下ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ串联基因,克隆到ＸｈｏＩ切割的ｐＥＴ15ｂｃｒｔＥ上,筛选与ｃｒｔＥ方向相同的克隆,得到重组质粒ｐＥＴ15ｂｃｒｔＥＩＢ,用ＮｄｅＩ和ＸｈｏＩ切下ｃｒｔＹ基因,克隆到经同样酶切的ｐＥＴ15ｂ上构建ｐＥＴ15ｂｃｒｔＹ,再用ＢｇｌⅡ和ＨｉｎｄⅢ切下ｃｒｔＹ基因,克隆到经ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切的ｐＡＣＹＣ184上构建ｐＡＣＹＣ184ｃｒｔＹ。1.4　重组质粒的表达与β胡萝卜素的累积将ｐＥＴ15ｂｃｒｔＥＩＢ质粒转化Ｅ.ｃｏｌｉＢＬ21(ＤＥ3),得到生产番茄红素的菌体,再用质粒ｐＡＣＹＣ184ｃｒｔＹ转化此菌体,在含有100μｇ/ｍｌ氨苄青霉素和30μｇ/ｍｌ氯霉素两种抗生素的ＬＢ固体培养基中筛选出生产β胡萝卜素的工程菌,将筛选出的基因工程菌单菌落接种于20ｍｌ含100μｇ/ｍｌ氨苄青霉素和30μｇ/ｍｌ氯霉素的ＬＢ液体培养基中,37℃振荡过夜,按1∶20的比例接种于含同样两种抗生素的液体ＬＢ培养基中,37℃振荡培养6ｈ,加入ＩＰＴＧ至终浓度为0.5ｍｍｏｌ/Ｌ,培养温度降至30℃,诱导14ｈ后,4℃,8000ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ收集菌体。

1.5　色素的提取及鉴定

将上述湿菌体用磷酸缓冲液(0.1ｍｏｌ/Ｌ,ｐＨ7.5)洗涤,沉淀重悬于丙酮中,4℃,暗处浸提30ｍｉｎ,10000ｒ/ｍｉｎ离心5ｍｉｎ,吸取上清液于暗处保存。再用丙酮抽提3次,合并提取液,用分光光度计分别对所得色素样品和β胡萝卜素、番茄红素标准品进行扫描,并测定样品在450ｎｍ下的吸光值。样品类胡萝卜素的含量按照以下公式计算[9]:类胡萝卜素(ｍｇ)=混合液体积(ｍｌ)×混合液在450ｎｍ下的吸光值×10÷2500。公式中2500是类胡萝卜素的平均消光系数(Ｅ1ｃｍ1%)。

2　结　果

2.1　重组质粒的构建

将ｃｒｔＥ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ串联在一起,插入质粒ｐＥＴ15ｂ上的Ｔ7启动子下游,构建适合这三个基因共表达的质粒ｐＥＴ15ｂｃｒｔＥＩＢ(图1),3个基因下游含有表达载体提供的强转录终止信号。将ｃｒｔＹ插入质粒ｐＥＴ15ｂ上的Ｔ7启动子下游,用ＢｇｌⅡ和ＨｉｎｄⅢ将ｃｒｔＹ基因和Ｔ7启动子、Ｔ7终止子、核糖体结合位点一起切下,插入质粒ｐＡＣＹＣ184复制起点下游,构建含有Ｔ7启动子和Ｔ7终止子、核糖体结合位点的ｐＡＣＹＣ184ｃｒｔＹ(图2)。此两质粒共转化大肠杆菌后,可转录出包含ｃｒｔＥ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ三个基因信息的多顺反子ｍＲＮＡ和含基因ｃｒｔＹ信息的ｍＲ ＮＡ,其中ｃｒｔＥ上游含有质粒提供的核糖体结合位点,而ｃｒｔＩ和ｃｒｔＢ的上游分别含有其固有的核糖体结合位点,ｃｒｔＹ上游含有从质粒ｐＥＴ15ｂ一起切割下来的核糖体结合位点。

2.2　重组质粒的表达与色素累积

将含有ｃｒｔＥ,ｃｒｔＩ,ｃｒｔＢ的质粒ｐＥＴ15ｂｃｒｔＥＩＢ和含有ｃｒｔＹ基因的质粒ｐＡＣＹＣ184ｃｒｔＹ共转化Ｅ.ｃｏｌｉＢＬ21(ＤＥ3),ＩＰＴＧ诱导后,菌体呈橙色,说明新的代谢途径在工程菌内建成,该途径完成了一种橙色天然色素的合成,这也说明工程菌中的上述4个基因在大肠杆菌中实现了表达,ｃｒｔＥ,ｃｒｔＢ,ｃｒｔＩ3个基因表达的ＧＧＰＰ合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶具有利用大肠杆菌自身含有的底物合成番茄红素的能力,ｃｒｔＹ基因表达的番茄红素β环化酶具有使番茄红素转化为β胡萝卜素的活性[10]。

2.3　工程菌色素的提取及鉴定

工程菌经有机溶剂浸提可得黄色浸提液,理论上该色素应为β胡萝卜素,但可能含有少量未来得及转化的番茄红素,将β胡萝卜素、番茄红素标准品和样品溶于乙醇,用分光光度计在380～600ｎｍ波长范围内扫描,得到的吸收光谱如图3,从图中可以看出,这三个吸收光谱形状基本相似,均为类胡萝卜素的三指形特征吸收峰,中间峰高于两边肩峰,为最大吸收峰,且右肩峰高于左肩峰,β胡萝卜素标准品、番茄红素标准品和样品的最大吸收峰分别在450、472、452ｎｍ处,样品最大吸收峰452ｎｍ与β胡萝卜素标准品的最大吸收峰450ｎｍ接近。通过吸收光谱分析可以推断,工程菌中合成的橙色的天然色素为β胡萝卜素,β胡萝卜素含量为3.5ｍｇ/ｇ·ＤＷ(每升发酵液可得6.53ｇ干菌体)。

3　讨　论

目前,β胡萝卜素的生产方法有微生物发酵、植物提取和化学合成3种。虽然β胡萝卜素在很多植物和微生物中均有分布,但由于其中所含色素的成分复杂,且很多β胡萝卜素与脂肪酸形成酯,致使提取单一组分的成本较高。天然β胡萝卜素为反式和顺式的混合构型,而化学合成的β胡萝卜素为全反式构型,这种单一的结构使得产品的生物利用率较低,其在人体内的吸收率仅为天然产品的10%。化学合成法生产的β胡萝卜素,还残留少量合成过程中加入的一些成分,能致染色体畸变,人体过多摄入会造成中毒[1]。生物发酵法生产的β胡萝卜素为天然产品,人体吸收好,营养成分高,无毒副作用[5]。目前,通过大面积养殖盐藻获得类胡萝卜素的方法最为成熟,但杜氏盐藻的养殖需要长时期的高温和强烈光照,且需要10%以上的高盐浓度。国内许多地方也尝试过培养,但其生物量和类胡萝卜素含量都不是太高[11]。随着类胡萝卜素合成途径的阐明和相关基因的相继克隆,为通过基因工程的办法使原本不产生类胡萝卜素的生物大量累积这类色素成为可能,工业上可为类胡萝卜素的生产提供新的原料来源。目前已成功的实现了类胡萝卜素合成代谢途径重建的微生物有大肠杆菌、酵母菌、欧文氏菌等。

大肠杆菌、酵母菌、欧文氏菌等。本实验将β胡萝卜素合成相关基因ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ都置于强启动子(Ｔ7启动子)的下游,且在基因的下游利用强的终止子(Ｔ7终止子)进行表达,质粒ｐＥＴ15ｂｃｒｔＥＩＢ构建时将ｃｒｔＥ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ串联后置于质粒本身含有的Ｔ7强启动子的下游,质粒ｐＡＣＹＣ184ｃｒｔＹ构建时,通过对质粒进行改造,使其插入基因ｃｒｔＹ的上游也含有从质粒ｐＥＴ15ｂ上切下的Ｔ7强启动子,转基因的工程菌大量累积β胡萝卜素,其含量明显高于利用这4个基因本身启动子构建的工程菌中的色素含量[12,13],推测这4个基因的表达水平直接影响β胡萝卜素合成,暗示ＧＧＰＰ合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素去饱和酶、番茄红素β环化酶所催化的反应中的一步或多步反应是β胡萝卜素合成的限速步骤。Ｋａｎｇ等[14]发现ｄｘｓ、ａｐｐＹ、ｃｒｌ和ｒｐｏＳ过量表达会促进工程菌番茄红素的累积,最高可达原工程菌产量的8倍,该研究对进一步通过工程菌中的相关基因进行改造以获得更高产β胡萝卜素的工程菌的研究提供了借鉴,同时β胡萝卜素前体物质番茄红素的增加,也会进一步促进番茄红素向β胡萝卜素的转化。本实验构建了生产β胡萝卜素的工程菌,该研究为通过对其培养条件的优化,进一步提高工程菌色素产量打下了基础。