重组人胰岛素原基因在培养的大鼠肝癌细胞中基因转移和表达
2007-04-15 09:17:10   来源：中国病理生理杂志   评论：0 点击：

　　糖尿病基因治疗国内外均处于基础研究阶段,国内此方面的研究甚少。通过基因转移技术将人胰岛素原基因导入糖尿病患者体内,以产生长期、稳定、按生理模式分泌的胰岛素,可以治疗1型糖尿病。但是该基因转入糖尿病患者体内或动物体内之前,必须在体外证明此基因具有长期、稳定、按生理模式调节胰岛素分泌的能力。大多数研究者所采用的突变人胰岛素原基因是突变2个位点,而本研究是在2点突变的基础上进行了3点突变,从而提高了胰岛素的表达量。通过把含重组人胰岛素原基因转入大鼠肝癌细胞CBRH7919[1],以检测该种细胞转染后38h及稳定转染后在不同葡萄糖浓度下其胰岛素的分泌情况。

材　料　和　方　法

1　材料　　大鼠肝癌细胞株CBRH7919细胞(中科院上海细胞所)。重组人胰岛素原基因质粒[PLXSN-(GL RE)3-BP-1MpINS3及(PLXSN-(GLRE)3-BP-1MpINS2]及包装成功的含有重组质粒的逆转录病毒上清,由本组研究人员前期实验完成。D-葡萄糖(华美公司)。小牛血清(郑州佰安生物工程有限公司)。RPMI-1640培养基(Gibco),G418及胰酶(Sigma),PCRmarkers及Neo基因引物(购自宝生物工程大连有限公司)。

2　方法

2 1　转染　将CBRH7919细胞接种于6孔培养板中,转染时各孔分别加入含有2点突变(INS2)及3点突变(INS3)胰岛素原基因的转染混合液各1mL,对照组加入完全培养液各1mL。培养14h后分别加入不同浓度葡萄糖,使其葡萄糖终浓度分别为0、5、15、25mmol/L继续培养24h。

2 2　胰岛素水平的检测　转染后38h各孔取培养液0 5mL到内分泌实验室用化学发光法检测胰岛素水平。

2 3　G418筛选阳性细胞克隆及扩大培养　转染后38h加入400mg/L的G418选择培养液,7d后筛选出阳性细胞克隆加入200mg/L的G418扩大培养。稳定转染后,在不同葡萄糖浓度下,转染重组人胰岛素原基因的肝癌细胞胰岛素分泌水平的检测。

2 4　检测基因整合情况　用酚-氯仿-异戊醇抽提DNA的方法分别从CB-INS3及CB-INS2及CB中提取细胞染色体DNA。根据待测基因设计引物(P1:5 -CCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC-3 ;P2:5 -GAGCCTGGGGACTTTCCACACCC-3 );扩增长度为970bpPCR产物,循环条件:94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环之后72℃延伸5min。PCR反应后行聚丙烯酰胺凝胶电泳,用银染的方法显谱。

3　统计学处理　　数据用SPSS11 0统计软件包的方差分析方法(One-wayANOVA过程)进行比较,数据以 x±s表示。

结　　果1　转染细胞38h胰岛素水平检测　　CB-INS2在0-15mmol/L葡萄糖浓度的培养液时均未测出胰岛素,在25mmol/L葡萄糖浓度时胰岛素分泌量为(2 10±0 23)U/L;CB-INS3在0-25mmol/L葡萄糖浓度下,胰岛素分泌量分别为(5 03±0 72)U/L、(9 57±0 49)U/L、(32 60±1 96)U/L、(43 90±2 30)U/L;各组间差异显著

2　大鼠肝癌CBRH7919阳性克隆形成

　　未转染重组胰岛素原基因的大鼠肝癌细胞在加G418后3d内均死亡,而转染重组胰岛素基因的肝癌细胞形成多个克隆,图2是其中的2个克隆。

3　转染肝癌细胞稳定表达后胰岛素水平检测　　将阳性克隆细胞经扩大培养稳定表达后,CB-INS2在0-15mmol/L葡萄糖浓度时未测到胰岛素分泌,25mmol/L时胰岛素分泌量为(2 05±0 17)U/L。CB-INS3在上述葡萄糖浓度下,胰岛素分泌量分别为(3 57±0 21)U/L、(5 30±0 20)U/L、(16 27±0 87)U/L、(23 23±1 12)U/L,各组间差异显著(P<0 05,图3)。

4　基因整合的鉴定　　经扩大培养的细胞基因组都扩增出一特异的长970bp的目的基因片段电泳条带,而未转染细胞组则无此条带(图4),证明重组质粒已在细胞基因组上稳定整合。

讨　　论　

　若能在患者的胰外组织建立呈生理模式调控的胰岛素分泌将是治疗1型糖尿病的理想疗法。利用基因工程技术将胰岛素原基因转入非β细胞,发展β细胞替代物,使这种疗法成为可能。胰岛素基因治疗应实现2个环节:①转染的细胞有合适的酶学生化机制,可以将胰岛素原正确处理为成熟的、有生物活性的胰岛素;②对葡萄糖及胰岛素敏感的胰岛素表达系统,能够稳定转染到靶细胞内,并使胰岛素基因的转录、表达和释放对葡萄糖浓度改变作出正确的反应,同时过高的胰岛素水平能抑制上述过程。第一个环节目前已经成功实现,Hori等[2]及袁凤山等[3]均已从人的胰腺中成功提取胰岛素原基因,并实现基因定点突变。虽然两者以后的研究方法不同,但目的都是构建产生胰岛素的组织或细胞。目前对于胰岛素原基因的突变,大多采用2点突变,即在人胰岛素原基因B-C连接处及C-A连接处[4,5]惤?卸ǖ阃槐涫蛊涑晌?鼙籪urin酶识别的序列。这种突变产生的胰岛素量较少。Debyra等[6]发现高胰岛素血症患者的胰岛素原基因有一种自发突变,将这种突变引入上述突变的胰岛素原基因中,胰岛素分泌量增加10-100倍。故本研究小组在上述两点突变的基础上,把胰岛素原基因再次进行第3点突变,即将B链第10位组氨酸突变为天冬氨酸,这一过程由本组人员前期完成。本实验将含有2点突变的胰岛素原基因及含有3点突变人胰岛素原基因重组质粒转染到大鼠肝癌细胞CBRH7919,显示出胰岛素分泌量3点突变比2点突变者增加约23倍,与文献报道相一致。　　第二个环节即胰岛素原基因转移和胰岛素释放调控问题是目前研究的热点问题。基因转移以往应用较多是脂质体转染的方法。1993年推出一种多聚阳离子脂质体转染试剂[7],用该试剂能获得更高的转染效率及即时性的DNA的高表达,但其缺点是转入的基因不能稳定长期表达。为了克服这一不足,我们使用了逆转录病毒载体来介导,将构建于逆转录病毒载体上的重组人胰岛素原基因通过脂质体转染法导入病毒包装细胞,从包装细胞的培养上清中获得包装好的高浓度的缺陷型病毒[8],用它转染大鼠肝癌细胞,可使基因永久地表达,本研究结果证实了重组人胰岛素原基因已整合到大鼠肝癌细胞的染色体中。

　　胰岛素释放的调控问题是另一个需解决的问题。无序的胰岛素分泌不能对血糖变化做出及时反应,不能使血糖保持在稳定的生理范围内,无法应用于动物模型及临床。研究表明,胰腺β细胞中受生理浓度葡萄糖调节的胰岛素合成和分泌需要细胞中的多种结构和蛋白。肝细胞内也有几个基因的转录调节也是受细胞外葡萄糖调节的,如葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)启动子、L型丙酮酸激酶(L-pyruvateki nase,LPK)启动子等。Thompson等[9]已证明肝脏丙酮酸激酶LPK的启动子葡萄糖反应元件(GLRE)调节葡萄糖的反馈,其活性对葡萄糖介导的LPKmRNA产物变化起主要作用。基于上述理论及事实,本研究小组采用大鼠肝丙酮酸羧激酶(L-PK)基因启动子中的3个拷贝的葡萄糖反应元件(GLRE)3和胰岛素生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)作为胰岛素原基因的调控因子,使该重组胰岛素原基因的表达和调控受葡萄糖和胰岛素的双重控制。肝丙酮酸羧激酶(L-PK)基因启动子中的葡萄糖反应元件(GL RE)主要在肝脏表达,因此本实验采用了大鼠的肝癌细胞CBRH7919细胞系作为靶细胞,并证实重组的人胰岛素原基因在培养的大鼠肝癌细胞中的表达受细胞外葡萄糖浓度的调节:转染重组人胰岛素原基因后,CBRH7919细胞能够分泌胰岛素,且分泌的胰岛素水平在一定的葡萄糖浓度内(0-25mmol/L),随葡萄糖浓度的升高而增多。这与He等[10]报道的结果相类似。这一结果表明所构建的重组胰岛素原基因具有根据细胞外葡萄糖浓度的变化调节胰岛素分泌的能力。

　　目前大多数转染胰岛素原基因的细胞只是瞬时表达胰岛素,即目的基因并未整合到靶细胞的染色体中,而本研究不仅证明了重组的胰岛素原基因能够使瞬时胰岛素的分泌受葡萄糖的反应性调节,并把胰岛素原基因稳定整合在肝癌细胞染色体内,使该基因能够在宿主细胞长期受葡萄糖调控表达。