纳豆芽孢杆菌的发酵工艺研究
2007-04-03 11:02:10   来源：中国调味品   评论：0 点击：

　　从日本和传统食品———纳豆中首次提取出纳豆芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｎａｔｔｏ)[1],经菌种鉴定属于枯草芽孢菌属的一个亚种。1987年,须见洋行发现纳豆的发酵产物中含有一种丝氨酸蛋白酶[2],具有溶解交联纤维蛋白功能,可以治疗和预防脑血栓,并定名为纳豆激酶。目前常用的治疗血栓病的药品有:链激酶(ＳＫ)、尿激酶(ＵＫ)、重组组织纤溶酶原激活剂(ｔ-ＰＡ)和尿激酶原(ｐｒｏ-ＵＫ)等,但它们有的毒副作用大,有的在体内半衰期短,有的价格昂贵[3]。作为一种新型的溶栓药物,纳豆激酶与当前使用的同类产品相比,具有很多优点:来源于长期食用的食品,所以安全、无毒;分子量小易吸收;纳豆芽孢杆菌可以液体发酵培养,具有大规模生产开发前景[4]。以筛选得到的一株纳豆芽孢杆菌为研究对象,对其发酵产酶条件进行了探索,并在20Ｌ自动发酵罐中放大培养,为规模化发酵做了准备工作。

1　材料与方法

1 1　菌种纳豆芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｎａｔｔｏ),从纳豆中分离,本实验室保存。

1 2　培养基　　斜面培养基(%):蛋白胨1,牛肉膏0.5,ＮａＣｌ0.5,琼脂2,ｐＨ7.2～7.5。

　　种子培养基(%):蛋白胨1,牛肉膏0.5,ＮａＣｌ0.5,ｐＨ7.2～7.5。发酵培养基(%):葡萄糖1,蛋白胨1,ＫＨ2ＰＯ40.2,Ｋ2ＨＰＯ40 4,ＭｇＳＯ40.05,ｐＨ7.2～7.5。20Ｌ自动发酵罐培养基(%):葡萄糖1,豆饼粉2,ＫＨ2ＰＯ40.2,Ｋ2ＨＰＯ40.4,ＭｇＳＯ40.05,ｐＨ7.2～7.5。

1 3　试剂及仪器牛纤维蛋白原、凝血酶:Ｓｉｇｍａ公司。尿激酶(1000Ｕ/支):天津市生物化学制药厂。20Ｌ自动发酵罐:江苏镇江东方生物工程设备技术公司。

1 4　培养方法

1 4 1　菌种活化将保存的菌种转接到斜面培养基,34℃培养24ｈ,备用。

1 4 2　种子培养液的制备

取一环活化的菌种,接入装量为30ｍＬ种子培养基的150ｍＬ三角瓶中,34℃,200ｒ/ｍｉｎ,培养18ｈ。

1 4 3　摇瓶发酵用灭过菌的移液管吸2ｍＬ种子培养液,接入装量为50ｍＬ发酵培养液的300ｍＬ三角瓶中,37℃,200ｒ/ｍｉｎ,约24ｈ开始产芽孢,镜检、测定酶活力。

1 4 4　自动发酵罐发酵20Ｌ发酵罐装量10Ｌ,灭菌,种子培养液的接种量10%,37℃,通气量(发酵液体积∶每分钟通气的体积)1∶1,定时镜检、测定。

1 5　酶活力的测定方法-纤维蛋白平板法参照Ａｓｔｒｕｐ法[5]加以改进。用ｐＨ值7 4的磷酸缓冲液将尿激酶(1000Ｕ/支)稀释至1000Ｕ/ｍＬ、2000Ｕ/ｍＬ、3000Ｕ/ｍＬ、5000Ｕ/ｍＬ。

取发酵液加入1ｍＬ离心管,16000转,5ｍｉｎ离心,取上清液待测。每次测定酶活时,在纤维蛋白平板上除了加待测液,还加入四种标准液作对照。

1 6　菌数测定血球计数法和活菌平板计数法。

2　结果与分析

2 1　发酵条件对纳豆激酶产量的影响

2 1 1　温度对纳豆激酶产量的影响分别在不同温度下摇瓶发酵,测定酶活力见图1。H

由图1可见,纳豆激酶的产量在37℃左右最高,其它温度下产酶较少。

2 1 2　ｐＨ值对发酵产酶的影响分别调整发酵液的起始ｐＨ在5.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0进行摇瓶发酵,培养24ｈ,测定酶活力见图2。%

由图2可见,纳豆激酶的产率在发酵液的起始ｐＨ值为8.0时最高,ｐＨ值小于5.0时,不能测出酶活。

2 1 3　通气量对发酵产酶的影响分别调整三角瓶的装量进行摇瓶发酵,培养24ｈ,测定酶活力见图3。

由图3中可见,纳豆激酶的产量在三角瓶装量大于30/150ｍＬ后开始逐渐下降,50/150ｍＬ装量的发酵液菌数较少,菌型细弱,产芽孢少。

2 2　培养基的组成对纳豆激酶产量的影响

2 2 1　碳源对发酵产酶的影响分别选择葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作碳源,浓度均为1%,其他成分同发酵培养基。24ｈ后镜检发现:葡萄糖、麦芽糖、蔗糖培养液中菌型为饱满的杆菌,30%形成芽孢;乳糖培养液中菌型为细、弱的杆菌,没有芽孢;可溶性淀粉培养液中全部生成芽孢,但菌数较少。测定纳豆激酶活力见图4。

由图4可以见,选择葡萄糖、麦芽糖作碳源产酶较高。

2 2 2　氮源对发酵产酶的影响

分别选择蛋白胨、豆饼粉、大豆粉、胰胨作碳源,浓度均为1%,其它成分同发酵培养基。24ｈ后镜检发现:蛋白胨培养液中菌型为饱满的杆菌,30%形成芽孢;胰胨培养液中菌型为细、弱的杆菌,没有芽孢;豆饼粉、豆粉培养液中正常杆菌,50%形成芽孢。测定纳豆激酶活力见图5。

由图5可见,选择豆饼粉或豆粉作氮源产酶最高,从成本考虑选豆饼粉最合适。

2 2 3　金属离子对发酵产酶的影响在发酵培养基中添加如下几种金属离子:Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｃｕ2+、Ｍｎ2+、Ｚｎ2+、Ｆｅ3+,离子浓度均为0.002ｍｏｌ/ｍＬ,其他成分同发酵培养基。24ｈ后镜检发现:Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｚｎ2+、Ｆｅ3+,培养液中菌型为饱满的杆菌,少量芽孢;Ｃｕ2+培养液中基本无菌,也没有芽孢;Ｍｎ2+培养液中菌型细弱,芽孢也很少。测定纳豆激酶活力见图6。

由图6可见,Ｃａ2+、Ｍｇ2+有助于菌的生长和产酶;Ｚｎ2+和Ｍｎ2+不利于纳豆芽孢杆菌的生长;

Ｃｕ2+对该菌的生长和产酶有强烈地抑制作用。

2 3　20Ｌ自动发酵罐培养从开始后6ｈ开始每隔4ｈ取样,镜检,测定ｐＨ值、酶活力,血球计数板测定菌数。生长情况见表1。

由表1和图7可以看出,纳豆芽孢杆菌在接种量10%时,约有5～6ｈ的生长延滞期,6～18ｈ是生长对数期,20ｈ进入平稳期,这时菌数最高,22ｈ开始出现芽孢,42ｈ芽孢达到80%,发酵结束。纳豆激酵的产生要滞后于菌体增殖,在22ｈ菌体将要产芽孢时酶活达到最高,然后酶的活力稍有降低。发酵液取样,进行活菌平板计数:约30亿/ｍＬ,与血球计数板法误差很小。3　结果与讨论纳豆芽孢杆菌是专性好氧菌,通气量与是否形成芽孢,芽孢的产生时间有很大关系,通气不足时,形成芽孢就要延迟甚至不形成芽孢。纳豆芽孢杆菌在开始产芽孢时纤溶酶的产率最高,可以达到2031.5Ｕ/ｍＬ。纳豆激酶是纳豆芽孢杆菌的次级代谢产物,将要产芽孢时产酶速率最高,芽孢形成后基本不再产酶,纳豆激酶的合成可能是滞后合成型,即在菌体繁殖期后才开始大量积累,其产生机理和合成机制还需要进一步的研究。菌数与纳豆激酶的产量是正比关系,发酵罐的菌数还可以提高,发酵条件还需要进一步优化。纳豆激酶的测定方法一般采用纤维蛋白平板法,实验发现原方法影响因素很多:如平板厚度,孵育时间等,结果造成采用标准曲线法的平行性很差,所以每次测定时在同一平板上除了加待测液,还加入标准液作对照,这样测定的误差会减小很多。