重组质粒在生防菌成团泛菌中的稳定性
2007-03-15 16:11:01   来源：本站原创   评论：0 点击：

赵立平　张 丽　李艳琴　申 泉　肖 虹

摘要: 用PCR方法将广宿主范围质粒RK2中控制稳定性的片段parDE克隆到pGEM-T载体上，然后插入到分泌表达载体pExSec1的BamHI切点上，得到两个新载体pZL2和pZL3，其中parDE的转录方向分别与T7启动子相同和相反。经酶切物理图谱分析和PCR扩增验证后，将pZL2 和pZL3分别电击转化到成团泛菌308R中，在无抗生素的LB培养基中生长100代后仍100%地保留在细胞内。新质粒在植物叶面生长的细胞内也100%稳定。
关键词: 成团泛菌; 质粒稳定性; RK2; parDE　
分类号: Q939.11; Q78

Use of parDE Region of the Broad-host Range Plasmid RK2
　for Construction of Plasmid
Vectors Stably Maintained in Pantoea agglomerans

ZHAO Li-ping　ZHANG Li　LI Yan-qin　SHEN Quan　XIAO Hong
(Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Abstract：　Pantoea agglomerans has been widely used for biological control of many leaf diseases due to its ability of competitively colonize plant surface and the ability of producing versatile antimicrobials. Recombinant DNA technology can be exploited to genetically engineer the bacterium for better efficacy of disease control. Yet, many presently available plasmid vectors such as pCPP9 or pExSec1 are unstable in P.agglomerans, more than 99% of cells lost the plasmids after 100 generation of growth in LB medium. The parDE fragment of RK2 was amplified by PCR with pTR102 as template and cloned into pGEM-T to get pZL1. The 0.8kb fragment was cut and religated with BamHI-cut pExSec1, a secretion-expression vector based on pUC21. Two new plasmids pZL2 and pZL3 with parDE inserted in different transcriptional orientation relative to T7 promoter were obtained and verified by physical mapping and PCR amplification. pZL2 and pZL3 were transformed into P.agglomerans 308R by electroporation and found to be 100% maintained in the cell after 100 generation growth in antibiotic-free LB medium. These plasmids were also stably maintained in cells growing in planta.
Key words: Pantoea agglomerans； plasmid stability； RK2； parDE

　　成团泛菌（Pantoea agglomerans）原名草生欧氏杆菌（Erwinia herbicola），是植物体上常见的附生菌，可产生多种抗生物质，在植物体上定殖的能力也比较强。因此，有许多研究者利用成团泛菌进行植物病害的生物防治^［1］。运用基因工程技术对野生型生防菌进行有目的的改造，构建重组生防菌，可以拓宽生防菌的防治范围和提高防治效果，这已经成为国际植病生防研究领域的热门课题。质粒作为基因载体在生防工程菌的构建中起重要的作用。一个好的质粒载体应该在没有选择压的情况下，如在植物体内，具有稳定遗传的性质，以使外源基因正常遗传和表达。这样的载体在大规模发酵时可不使用抗生素，以降低生产成本^［2］。成团泛菌属肠杆菌科，在大肠杆菌(Escherichia coli)中发展出的许多载体如pUC系列，在该菌中可以复制；基于广宿主质粒的某些穿梭载体如pCPP9，也可用于该菌的文库构建。但是，我们在工作中发现目前使用的这些载体质粒在成团泛菌中的遗传稳定性不高，无论是LB培养基中还是植物叶面上，在没有抗生素选择压的情况下，每繁殖一代，都会有一定比例的后代细胞失去质粒，这对于工程菌的菌剂发酵制备及其防病效果均有不利影响。质粒的不稳定可以分两种情况，一是质粒在细胞分裂时向子代细胞分配不均匀造成的，叫做“分配不稳定”；另一种是因DNA的缺失、插入或重排引起“结构不稳定”^［2］。用于植病生防工程菌构建的质粒稳定性研究鲜见报道^［3］。广宿主范围质粒RK2与保证质粒正确分配有关的基因已被克隆在3.2kb的片段上，其中0.8kb的parDE可使多种异源质粒在苜蓿根瘤菌中稳定，特别是从根瘤中回收的细菌可以100％带着质粒^［4］。这些结果显示了parDE片段用于构建在植物细菌中稳定遗传的载体的潜力。本文报道了利用parDE片段提高重组质粒在成团泛菌中稳定性的研究结果。

1　材料与方法
1.1　菌株与质粒
　　本研究所用的菌株与质粒的特性和来源见表。

表　本研究所用的菌株和质粒的特性和来源

2　结果与讨论
2.1　不同质粒在成团泛菌中的稳定性
　　我们首先测定了几种常用质粒在成团泛菌中的遗传稳定性。质粒pCPP9是一个穿梭载体，它可以通过三亲接合在大肠杆菌和欧文氏杆菌之间转移，它还带有λ噬菌体的cos位点，可以用于构建基因文库。该质粒已成功地用于克隆成团泛菌的抗生素基因簇^［5］。质粒pExSec1是基于pUC21的分泌表达载体^［6］。pTR102是mini-RK2衍生质粒，带有RK2中3.2kb的稳定性片段^［4］。这3个质粒通过电击法转化到成团泛菌308R中后，于LB中连续传代进行稳定性测定。细胞繁殖100代后，只有1%的细胞仍带有pCPP9，10%的细胞带有pExSec1，而pTR102却100%保留在细胞中。这一结果提示我们RK2的稳定性片段有可能会提高不同质粒在成团泛菌中的遗传稳定性。
2.2　parDE片段的克隆及其与分泌表达载体pExSec1的重组
　　根据Weinstein等^［4］工作，3.2kb的RK2稳定性片段中有5个基因，组成parCBA和parDE两个操纵子。parCBA只在特殊的条件下与维持质粒稳定性有关，0.8kb的parDE则是质粒稳定不可缺少的，带有这一片段的不同质粒均可在苜蓿根瘤菌中稳定。因此，我们尝试将parDE片段重组到分泌表达载体pExSec1上，以观察该片段能否在成团泛菌中使质粒稳定。
　　根据GeneBank中登录的790bps的parDE基因序列，我们设计了一对引物P₁和P₂，分别包括了编码链和互补链5’端以下20bps序列，另外各增加了包含BamHI识别位点在内的10bps序列，以便在扩增出的目的片段上下游各外挂1个BamHI切点。用pTR102的DNA为模板，P₁和P₂作引物扩增出了810bps的目的片段，经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收后与pGEM-T载体DNA连接，转化DH5α，通过质粒提取、酶切，鉴定出重组质粒pZL1。BamHI切割pZL1 DNA，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收0.8kb的片段，与经同一酶切、CIP脱除5’磷酸基团的pExSec1 DNA连接后转化DH5α，通过质粒提取、酶切，鉴定出重组质粒pZL2和pZL3，前者parDE的转录方向与T7启动子的方向相同，后者则相反（图1）。重组质粒经酶切物理图谱分析和PCR扩增，证明确切无误（图2）。

图 1　带有parDE的新载体pZL2、pZL3的物理图谱

图 2　重组质粒pZL2和pZL3的验证

A.重组质粒的限制性酶切分析:1为λDNA/HindⅢ+EcoRI(分子量标记),2为pExSec1(载体),3为重组质粒pZL2,4为pZL2的BamHI消化产物,5为parDE片段,6为pZL2的NdeI消化产物,7为pZL3的NdeI消化产物;B.用P₁/P₂引物进行PCR扩增:1为λDNA/HindⅢ+EcoRI(分子量标记),2为PCR阴性对照,3为以pRT101为模板的PCR产物,4为以pZL2为模板的PCR产物,5为以pZL3为模板的PCR产物,6为parDE PCR产物,7为λDNA/HindⅢ+EcoRI(分子量标记)

2.3　带有parDE片段的pZL2在大肠杆菌中的遗传稳定性
　　带有parDE基于pExSec1的新质粒pZL2和pZL3构建好后，我们首先测定了pZL2在大肠杆菌中遗传稳定的情况。细胞分裂100代后，带有pExSec1的细胞有60％；200代后，带有pExSec1的细胞只剩下10％，而带有pZL2的细胞一直保持100％。提取质粒检测的结果与菌落计数的结果相吻合，表明parDE能够提高载体质粒pExSec1在大肠杆菌中的遗传稳定性。
2.4　带有parDE片段的pZL2和pZL3在成团泛菌中的稳定性
　　我们用电击法将pZL2和pZL3转化到成团泛菌308R中，经提取质粒、酶切验证后，将两种新的重组菌和308R（pExSec1）一起分别在不含抗生素的LB培养基中连续传代，测定3种质粒的遗传稳定性。经过200代后，不到1％的细胞带有pExSec1，而带有pZL2和pZL3的细胞仍有100％（图3）。这一结果与生长200代后质粒检测的结果一致，表明parDE片段可以使pExSec1在成团泛菌中获得稳定遗传的能力。此外，我们测定了这3种菌在番茄叶面上的质粒遗传稳定性，喷菌后套上塑料袋保湿，20天后回收细菌，pExSec1丢失55％，质粒pZL2和pZL3没有丢失（图4），质粒提取的数据与菌落计数的结果相同。两组结果都显示parDE片段确实能够提高质粒pExSec1在成团泛菌308R中的遗传稳定性。

图 3　带有parDE新质粒在成团泛菌308R中的遗传稳定性

图 4　从番茄叶面回收的成团泛菌携带不同质粒的比例

　　几种不同质粒在成团泛菌中不能稳定遗传。将与质粒分配有关的基因簇0.8kb的parDE插入pExSec1中构建的质粒pZL2和pZL3，无论在人工培养条件下，还是在植物体内，都提高了在成团泛菌中的遗传稳定性。本文证明了一点，即parDE可以使不同复制子的质粒在成团泛菌中稳定遗传，这对重组生防菌的大规模发酵制备和田间生物防治效果的稳定都具有重要意义。此外，pExSec1作为一种分泌表达载体用于重组蛋白的分泌型表达效果较好，但它本身在大肠杆菌中不够稳定。经改造后，该载体可以在大肠杆菌中稳定遗传，培养重组菌时可以不用加抗生素，这对于利用该载体生产重组蛋白也有一定的意义。我们可以采取同样的方法，构建具有遗传稳定性的其它质粒载体，用于各种生防工程菌和固氮工程菌的研究。

　　*　德国明斯大学K.Heckmann教授、美国加州大学D.R.Helinski教授、美国康乃尔大学S.V.Beer教授、华中农业大学周俊初教授提供了部分载体质粒，工作中得到山西大学生物工程实验室梁爱华教授的帮助，特此致谢。

　　基金项目：国家“863”高技术计划（863-101-03-02-02）；国家自然科学基金（39770509）；山西省自然科学基金（971065）

作者简介：赵立平，男，36岁，博士，教授。

作者单位：赵立平　张丽　李艳琴　申泉　肖虹(山西大学生物工程实验室， 太原　030006）

参考文献
　[1]Kearns L P,Mahanty H K. Antibiotic production by Erwinia herbicola Eh1087:its role in inhibition of Erwinia amylovora and partial characterization of antibiotic biosynthesis genes. Appl.Environ.Microbiology,1998,64(5):1837～1844.
　[2]李永红,王二力,俞俊棠. 工程菌的不稳定性及对策. 生物工程学报，1988，4（2）：81～86.
　[3]朱光富,周俊初,陈华癸. 外源质粒（基因）导入花生根瘤菌的行为分析. 遗传学报，1996，23（2）：131～141.
　[4]Weinstein M,Roberts R C,Helinski D R. A region of the broad-host-range plasmid RK2 cause stable in planta inheritance of plasmids in Rhizobium meliloti cells isolated from alfalfa root nodules． J. Bacteriol.,1992，174（22）:7486～7489．
　[5]Vanneste J L, Yu J,Beer S V. Role of antibiotic production by Erwinia herbicola Eh252 in biological control of Erwinia amylovora. J. Bacteriol.,1992,174（9）:2785～2796.
　[6]Brunen-Nieweler C,Meyer F,Heckmann K. Expression of the pheromone 3-encoding gene of Euplotes octocarinatus using a novel bacterial secretion vector． Gene，1994，150（1）:187～192．
　[7]Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989.
　[8]Gerlitz M, Hrabak O,Schwab H. Partitioning of broad-host-range plasmid RP4 is a complex system involving site-specific recombination. J. Bacteriol.,1990,172（11）: 6194～6203.

收稿日期：1998-07-16