双向电泳实验过程及相关溶液配置
2007-03-13 19:15:47   来源：本站原创   评论：0 点击：

A．        实验过程
一、        实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二、        实验步骤：
1. 样品的溶解
取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。其中每隔10～15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。
2. Bradford法测蛋白含量
取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
    取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如：
   
编号        蛋白量（ul）        Buffer(ul)        Bradford(ml)        OD595值
1        0        80        4        0
2        5        75        4        0.024
3        10        70        4        0.061
4        15        65        4        0.091
5        20        60        4        0.116
Bt4        2        78        4        0.079
Bt4        4        76        4       
转Bt4        2        78        4        0.075
转Bt4        4        76        4       

  标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。 a、b通过作图输入数据可知     
相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得
OD值测量过程：
比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。
3. 双向电泳第一向---IEF（双向电泳中一律使用超纯水）
3.1 水化液的制备
称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。
    在含300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，        振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。
   3.2 点样，上胶
        分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline  DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平。
   3.3  IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20oC）
       S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)
       S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)
   S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)
S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)
S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step)       共计44110vhs, 19.5小时
其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦
3.4 平衡
    用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。  注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。
     平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的Marker，转入SDS—PAGE胶面上，保持紧密贴合；同样在第二次平衡时，煮5%的琼脂糖10ml。

4. 双向电泳第二向---SDS-PAGE
  4.1 配胶(两根胶条所用剂量)
   分离胶：（T=8%  80 ml）：溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED
           30 % 丙烯酰胺储液    21.28ml
           分离胶buffer          20ml      10%APS 220ul     TEMED 44 ul
           双蒸水               38.72ml
   浓缩胶：（T=4.8%   10ml）
           30 % 丙烯酰胺储液    1.6ml
           浓缩胶buffer          2.5ml     10%APS 30ul     TEMED 5ul
           双蒸水               5.9ml
  4.2 灌胶
      将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水,用保险膜封好。
  4.3 转移
      剪两个小的滤纸片，吸取Marker后，放入SDS—PAGE胶面的一端。然后，将平衡好的IPG胶条贴靠在玻璃板上,加少量的5%的琼脂糖溶液在胶面上(琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将IPG胶条缓缓加入SDS—PAGE胶面,其中不断补加5%的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡。
4.4 跑胶
     浓缩胶  13mA         分离胶  20mA        共约5.5个小时
5. 银染(两根胶条所用剂量)（银染特别注意用超纯水）
5.1  固定   30min    无水乙醇 200ml+乙酸50ml，用超纯水定容至500ml
5.2  敏化   30min    无水乙醇 150ml
                      Na2S2O3•5H2O  1.5688g
                      无水乙酸钠          34g  
                      先用水溶解Na2S2O3•5H2O和乙酸钠,再加乙醇,最后定容至500ml
5.3  洗涤   5min  ×  3次
5.4  银染   20min     AgNO3   1.25g   用超纯水定容至500ml
5.5  洗涤   1min  ×  2次
5.6  显影             无水Na2CO3    12.5g   用超纯水定容至500ml
                   甲醛(37%)0.1ml, 临时加
5.7  终止   10min     EDTA—Na2•2H2O  7.3g  用超纯水定容至500ml
5.8  洗涤   5min  ×  3次
注：整个双向电泳实验中全部使用超纯水，尽量减少离子的影响。
B．        实验相关试剂配制
1．        Bradford 工作液
95%乙醇             25ml       先用乙醇溶解考马斯亮兰G250，溶解完后再加磷
85%磷酸             52ml       酸，最后超纯水定容至500ml。过滤后置于棕色瓶
考马斯亮兰G250      0.035g     外加油皮纸保存（Bradford不稳定，一周内有效）
2．        裂解液
尿素                 8M
硫脲                 2M
CHAPS               4%
DTT                 60 mM
Tris—base            40 mM（如果有条件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate）
3.        水化液储液
尿素                 8M
硫脲                 2M
CHAPS               4%
Tris—base            40 mM
4.        分离胶buffer (pH8.8)                         250ml
SDS                  0.4%                   1g
Tris—HCl             1.5M                 45.4275g
5.        浓缩胶buffer (pH6.8)                         100ml
SDS                  0.4%                  0.4g
Tris—HCl             0.5M                  6.07g
6.        凝胶储存液（30%的丙烯酰胺）               250ml
Acr                  29.2%                  73g
Bis                   0.8%                   2g
7.        电极缓冲液（跑一次要配制2500ml）
甘氨酸               43.2g                  36g
Tris                  9g         或           7.5g
SDS                 3g                     2.5g               
超纯水定容至3000ml                         超纯水定容至2500ml
8．        0.5M Tris —HCl pH 6.8储液
6.1g Tris先用30ml超纯水溶解，再用46ml，3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml
9．        平衡液储液
脲（即尿素）         36g
甘油                 30%                  30ml
SDS                  1%                   1g
0.5M Tris—HCl pH6.8  10ml              超纯水定容至100ml
10. 平衡液A（一根胶条）
DTT                 20mg
平衡液储液           10ml
11．平衡液B（一根胶条）
碘乙酰氨             300mg
平衡液储液           10ml
0.05%溴酚兰          15ul              (平衡液A、B均需临时配制)
12．0.5%琼脂糖10ml
琼脂糖               0.05g
电极缓冲液           10ml
溴酚兰               25ul
补：4、5、6的溶液需过滤后储存于4OC备用。
C．        药品
CHAPS          兼性离子去垢剂    去垢剂可破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，
SDS            离子型去垢剂       提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出

尿素            离液剂             可改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质
硫脲            离液剂             变性并使蛋白失活。尿素和硫脲联合使用，可
                                   以大大增加蛋白质的溶解性

DTT            还原剂             断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。但过分提高DTT的浓度，由于它pKa在8左右，因而会影响pH梯度。DTT在碱性pH下会去质子化，等电聚焦时会损耗，导致二硫键复原，蛋白质沉淀

BSA                               Bradford中制作标准曲线用
无水乙醇                           和磷酸一起，提供Bradford中的环境
磷酸                               提供Bradford中的酸性环境
Tris                                构成缓冲液的成分，可用于抗衡pH的变化
IPG buffer
覆盖液                             即矿物油，防止水分蒸发，样品干燥。

丙烯酰胺（Acr）                     以丙烯酰胺为单体，甲叉二丙烯酰胺为交联剂，
甲叉二丙烯酰胺 （Bis）              在催化剂（Aps）和引发剂（TEMED）作用下，聚合交联成三维网状结构

琼脂糖
溴酚兰                            指示剂作用
碘乙酰氨（IAA）                   平衡液B中使用，中和A液中的DTT
正丁醇                          比聚丙烯酰胺密度小，用于凝胶制作过程中的压胶
甘油                               无机盐的良好溶剂，热稳定性好
Marker
考马斯亮兰G250（Bradford法用）    考马斯亮兰G250有红、蓝两种不同颜色的形式在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定，反应化合物在465~595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色 深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量
甘氨酸                             与Tris构成缓冲系统
AgNO3
EDTA                              金属螯合剂，可以结合银离子，终止银染过程