光合细菌产类胡萝卜素的培养基中无机盐组分筛选
2006-09-17 15:48:04   来源：不详   评论：0 点击：

    类胡萝卜素是自然界存在的一类重要色素，既赋予生物绚丽的色彩，又是重要的营养素，被FAO和WHO等国际组织认定为A类营养色素，并在50多个国家和地区获准作为营养、着色双重功能的添加剂。光合细菌（Photo-synthetic bacteria）是生产类胡萝卜素的主要微生物之一，因其生产周期短、不受季节限制而备受科学工作者的重视。培养基中无机盐组成对光合细菌产类胡萝卜素的研究虽有报道，但实验中多采用单因子实验。全因子实验虽然可对因子交互作用进行考察，但随着因子和水平数的增加，实验次数急剧增加。Plackett-Burman(PB）设计是一种以不完全平衡块为原理的实验设计，能够从众多变量中快速、有效地筛选出最为重要的一些因素，供进一步详细研究用，数据处理简单，可适用于多个实验因素，且因子的交互作用仅部分地与主因子发生混淆。目前PB实验设计已应用于生物工艺优化研究中。本实验用PB实验设计对培养基中MgSO4、KH2PO4、Na2HPO4、CaCl2、FeSO4、FeCl3、NaHCO3、 Na2CO3、NaCl、ZnSO4和EDTA-2Na 等11种可能影响菌体和类胡萝卜素产量的无机盐进行筛选，以确定对光合细菌生长及类胡萝卜素产量影响显著的因子，为其培养基中无机盐组分的进一步优化提供依据。
1   材料与方法
1.1    菌种来源
     光合细菌 由南京工业大学生物技术中心提供。
1.2   培养基
1.2.1 种子培养基
      苹果酸2.5g，酵母膏1g，(NH4)2SO4 1.25g，MgSO4 0.2g  CaCl2 0.07g，FeSO4 0.01g,KH2PO4 0.15g用蒸馏水溶解并定容至1L，PH7.0。
1.2.2 发酵培养基
     培养基的基本组成为：柠檬酸8.1g/L,NH4Cl 3.5g/L,玉米浆1.8g/L，PH7.0。然后根据文献报道，选取11种可能影响光合细菌生长和类胡萝卜素产量的无机盐，按Plackett-Burman设计进行不同组合，因子水平设计见表1。

           
1.3  培养方法
     活化后的液体种子按10%接种量接种于发酵培养基中，在培养温度28℃、光照强度1500lx（TES-1330照度计测得）和厌氧条件下培养5d。
1.4  测定指标与方法
1.4.1  菌体产量
     在Maria等的基础上加以改进。菌液在10000r/min条件下离心20min，弃去上清液，菌体用蒸馏水洗涤2次后再次离心，所得菌体在65℃下烘干至恒重。
1.4.2 类胡萝卜素产量
     在王岁楼等的基础上加以改进。菌体中加入浓度为3N的盐酸，28℃下振荡1.5 h后沸水浴4min，迅速冷却，离心（10000r/min，20min）弃上清液，沉淀用双蒸水洗涤2遍。在所得菌体中加入丙酮，在28℃下水浴振荡浸提30min，10000r/min冷冻离心20min ，取上清液。将所得类胡萝卜素提取液作适当稀释，于480nm 处测定其吸光值。按以下公式计算类胡萝卜素产量：
     类胡萝卜素产量（mg/L）=ADV1/0.16V2
     式中：A--480nm处的吸光值；D--稀释倍数；0.16--类胡萝卜素消光系数；V1--加入的提取剂体积；V2---用于提取色素的发酵液体积
1.5 数据处理
     每组实验处理重复3次，结果取平均值。运用JMP软件（）对数据进行统计分析，并在0.05水平上进行显著性检验。
2结果与分析
2.1 Plackett-Burman设计处理及响应值
    Plackett-Burman实验设计及光合细菌的菌体产量和类胡萝卜素产量响应值见表 2。

   
2.2  影响光合细菌生长的无机盐种类筛选
     利用JMP软件对菌体产量（表 2）进行逐步回归分析，得到以菌体产量为响应值的最优回归方程：
   Y=2.597+0.222*E+0.201*G+0.243*H
   R 2 =0.7342,Adj R 2 =0.6346
     此方程中 ：E=(EeSO4-0.005)/0.005
                G=(NaHCO3-0.5)/0.5
                H=(Na2CO3-0.5)/0.5。
     由表3可知，所得回归方程模型极显著（P=0.011），失拟性检验不显著（P=0.986），说明该回归模型在整个回归区域拟合度很好，决定系数（R 2）为 0.7342，这表明73.42%的实验数据变异性可用此回归模型来解释。
     显著性检验结果（表 4）表明，影响光合细菌生长的主要无机盐为：Na2CO3(P=0.0181)、FeSO4（P=0.0269） 和NaHCO3（P=0.0397）；由各显著因素的偏回归系数可知，在PB设计的二水平范围内，Na2CO3(B=0.222)、FeSO4（B=0.201） 和NaHCO3（B=0.243）对光合细菌生长均为正效应，即随着三者浓度的提高，光合细菌产量呈增加趋势。

   
2.3 影响类胡萝卜素产量的无机盐种类筛选
    对类胡萝卜素产量（表 1）进行逐步回归分析，得到以类胡萝卜素产量为响应值的最优回归方程：
    Y=8.949+0.316*A-0.616*B+0.477*C+1.417*E+0.906*G+1.299*H
   R 2 =0.9911,Adj R 2 =0.9804
    以上方程中：A=（MgSO4-0.1)/0.1,B=(KH2PO4-0.25)/0.25,C=(Na2HPO4-0.5)/0.5),
       E=(FeSO4-0.005)/0.005,g=(NaHCO3-0.5)/0.5,H=(Na2CO3-0.5)/0.5
    由表5可知，所得回归方程达到极显著水平（P<0.0001），说明该回归模型在被研究的整个回归区域拟合度很好。决定系数R 2=0.9911，这表明99.11%的实验数据的变异性可用此回归模型来解释。

   
    显著性检验结果（表6）表明，影响光合细菌产类胡萝卜素的主要无机盐为 ：MgSO4（P=0.0224)、KH2PO4（P=0.0014）、Na2HPO4（P=0.0044）、FeSO4(P<0.0001）、NaHCO3(P=0.0002）和Na2CO3(P<0.0001）。由各显著因素的偏回归系数可知，在PB设计的二水平范围内MgSO4（B=0.316)、Na2HPO4（B=0.477）、FeSO4(B=1.417）、NaHCO3(B=0.906）和Na2CO3(B=1.299）对光合细菌产类胡萝卜素为正效应，即随着五种无机盐浓度的提高，类胡萝卜素产量呈增加趋势。KH2PO4（B=-0.616）对光合细菌产类胡萝卜素为负效应，即随着KH2PO4浓度的提高，类胡萝卜素产量反而呈下降趋势。
3 讨论
    类胡萝卜素产量主要取决于光合细菌产量和菌体中的类胡萝卜素含量，因此在设法改变培养基中无机盐组成，以提高菌体产量的同时，必需保证无机盐的添加有利于光合细菌合成类胡萝卜素。FeSO4、NaHCO3和Na2CO3对光合细菌生长有显著影响且均表现为正效应。铁是呼吸链中铁硫蛋白酶的活性基，因此适量铁离子的存在可激活光合细菌代谢过程中某些酶的活力；NaHCO3和Na2CO3既可为光合细菌提供Na+，维持细胞渗透压，又可作为无机碳源，在培养过程中形成一定量的CO2，造成无氧环境，有利于光合细菌等厌氧菌的生长。
    MgSO4、KH2PO4、Na2HPO4、FeSO4、NaHCO3和Na2CO3对光合细菌产类胡萝卜素具有显著影响，其中除KH2PO4对类胡萝卜素产量为负效应外，其它五种无机盐均对类胡萝卜素产量呈正效应。镁是光合细菌中菌绿素的重要组成部分，影响光合细菌的光合作用过程，同时它也是柠檬酸脱氢酶等许多重要酶的激活剂，可促进相关的生理代谢；KH2PO4与Na2HPO4构成了培养液的缓冲体系，但磷酸盐浓度过高可能会影响类胡萝卜素的代谢合成过程；铁是细胞色素的组成部分，因此一定量铁离子的存在可以促进类胡萝卜素的合成，这与刘扬等的研究结果一致；NaHCO3和Na2CO3可通过促进光合细菌产量的增加，从而提高总的类胡萝卜素产量。