克拉维酸发酵液中碳源—甘油含量比色法测定
2006-09-17 15:48:01   来源：不详   评论：0 点击：

此文可供各种以甘油为碳源的发酵体系测定甘油含量的实验做参考，编者

    克拉维酸(clavulanic acid, CA)是棒状链霉菌(Streptomyces.clavuligerus)所产生的B-内酞胺酶抑制剂。克拉维酸抑菌作用较弱，但可以抑制耐药菌株产生的B-内酞胺酶对青霉素类、头抱菌素类药物的破坏，不论在体外或体内都能同耐药的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，特别是同金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和奇异变形菌所产生的B-内酞胺酶生成牢固不可逆的结合物，从而抑制耐药性细菌对B-内酞胺类抗生素的分解作用，恢复青霉素类及头抱菌素类抗生素对许多产生B-内酞胺酶的耐药菌的抗菌活性。
    目前克拉维酸的主要生产方法为发酵法，其生产菌为棒状链霉菌，所用培养基大多为复合培养基，含黄豆粉和甘油，其中的甘油作为碳源和合成克拉维酸合直接3C单元,其含量的高低对克拉维酸的产量有较大影响，因此在发酵过程中必须掌握其消耗情况，以便对发酵过程进行控制和优化，国内外有关发酵液月甘油含量测定方法的报道，主要是HPLC法、气相色谱法、快速酶法、高碘酸氧化—-滴定碘法等，但这些方法或者所需仪器昂贵，样品前处理麻烦;或者操作十步繁琐，实验精确度低。本实验正是从这些方面考虑，采用比色法测定发酵液中甘油的含量，说明该方法摧作简便，准确度高，比较适合检测克拉维酸发酵液中生油含量的变化。

1  材料与方法
1.1仪器与试剂
    Sigma低速离心机(德国Sigma公司);UV一9100紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);Sm-artsoecTM 3000分光光度计(美国BioRad公司);电子天平(上海精科天平厂);7L全自动发酵罐(上海保兴生物设备公司)。
    Nash试剂:精确称取乙酸按150 g,蒸馏水溶解，加入2 mL冰醋酸，2 mL乙酞丙酮，定容至1 000 mL。
    0.015 mol·L一1高碘酸钠溶液:精确称取高碘酸钠3.2 g,溶于0.12 mol·L一1的HCl，定容至1 000mL。
    0.1%L-鼠李糖:精确称取L-鼠李糖0.1 g溶于蒸馏水，定容至100 mL。
    甘油标准溶液的配制:先配制0.1 g·L一1的母液，再根据需要稀释成不同浓度的甘油溶液。
    以上所用试剂均为分析纯。
1.2材料
    菌种Streptomyces clavuligerus，天津科技大学分子生物学研究室保藏。
    种子培养基(g·L一1):TSB 30，淀粉10，pH6.8-7.0。
    发酵培养基(g·L_1 ):黄豆粉30，甘油25,KHZ P04 0.1, pH 7.5。
1.3方法
1.3.1培养方法
    用竹签从活化斜面上挖取约为1 cm x 1 cm的菌丝体连同培养基接于装有25 mL ISP培养基的250 mL挡板三角瓶中，于180r·min一1,28℃培养48 h，然后转接于装有50 mL TSB培养基的500 mL挡板三角瓶，于180 r·min一1,28℃培养36 h，然后按5%的接种量将种子液接入7L发酵罐中，发酵罐装液量为4L，控制DO在40%以上，温度为28℃，中间每隔一定时间取样，测定甘油含量。
1.3.2最大吸收波长的测定
    比色法的原理是酸性高碘酸盐氧化糖醇产生甲醛，在Nash试剂参与下生成黄色的化合物，该化合物在412 nm下有最大吸收峰。取一定浓度的标准品甘油溶液和样品稀释液各1 mL，分别置于不同比色管中，然后分别加入1 mL 0.015 mol *L一1高碘酸钠溶液，混匀，室温放置10 min，然后加入2mL0.1%L一鼠李糖溶液，以除去过多的高碘酸盐，混匀后加入4 mL新鲜配制的Nash试剂，在53℃水浴中加热15 min,侧其充分呈色，然后以试剂空白作参比，在400-700 nm波长区段测定其吸收光谱，样品和甘油标准品的吸书光谱均在412 nm处有最大吸收，故选择412 nm作戈测定波长。
1.3.3标准曲线的绘制
    取不同浓度的标准品甘油溶液各1 mL，按上述最大吸收波长的测定方法操作，显色后在412 nm下测其吸光度，绘制标准曲线。
1.3.4样品的刚定
    取不同时间的发酵液，3 500 r *min-1，离心2min，取上清液，稀释至适当浓度，然后按1.3.3标准滋线绘制方法进行测定，以试剂空白作参比。
2结果与讨论
2.，标准曲线的绘制
    通过测定多批不同浓度的甘油标准溶液的结果表明，甘油浓度在0一40 mg·L一1时，吸光度与甘油浓度线性关系良好(图1)，回归方程为:y=0.0236x-0.003 6,R2=0.9997，重复性很好。

           
2.2显色体系的稳定性
    取一定浓度的甘油标准溶液，按照1.3.1所述丈法，在不同时间下测定显色体系的吸光度，结果如表1所示.

         
   通过实验发现，该显色体系在2h内显色稳定，吸光度无明显变化，符合测定要求。
2.3精密度实验[(4]
    在相同条件下，进行3次平行实验，测定显色体系的吸光度，所得结果列于表2中。

          
    结果表明，该方法稳定，重现性很好。
2.4回收率实验[4]
    取不同发酵时间的发酵样，适当稀释后，加入一定量的甘油标准溶液，然后与原发酵样同时测定甘油含量，所得结果和计算所得的回收率列于表3中。

             结果表明，该方法准确度较高，发酵液中其他成分对结果的影响较小。因此该方法是可行的。
2.5与高碘酸氧化滴定碘法实验结果的比较
    在相同的实验条件下，与传统的甘油含量的测定方法—--高碘酸氧化滴定碘法做比较，实验结果如表4所示。

         
    结果表明比色法的精密度较高，且操作简便。
2.6不同时间发酵液甘油含量测定结果
    取不同时间的发酵液，按照前面所述的样品处理和测定方法，测定发酵液中甘油的含量，所得结果如表5。

         
    该结果表明甘油含量变化比较符合其代谢情况
3结论
    (1)在一定条件下，甘油与高碘酸钠溶液反应，Nash试剂参与反应的条件下，生成黄色的化合物，化合物稳定性好，在412 nm下有最大吸收。甘油浓度在一定范围内，线性关系良好。
    (2)通过精密度实验，证明用比色法测定发酵中甘油含量，实验重现性好;通过回收率实验证明该法准确度较高，简单可行，发酵液中其他组分对实验果的干扰较小。对发酵液中残留甘油的测定也符合油代谢情况。
    (3)通过与传统测定方法结果的比较，该法的密度高，可应用于克拉维酸发酵液中甘油含量的测定且该方法简单、方便、灵敏、精确，是一种比较理想的定克拉维酸发酵液中甘油含量的方法。