新鲜鸢尾根茎生香菌的分离及选育
2010-09-14 20:09:32   来源：本站原创   评论：0 点击：

摘要: 从新鲜的和经自然陈化的香根鸢尾根茎分离到16株内生真菌，通过初筛和复筛获得4株能促使新鲜根茎生香的内生真菌：RS-002、RS-007、RS-009和RS-016。并从中挑选出一株鸢尾酮高产菌株：Rs-007（720.19mg鸢尾酮/kg新鲜鸢尾干粉）。对 该菌株的产香条件进行正交法研究，正交实验的结果表明，影响发酵结果的四个因素的主次顺序为：鸢尾根茎∶玉米粉比值（A）>发酵温度（B）>发酵时间（C）>发酵固液比（D）。最适发酵条件：鸢尾根茎∶玉米粉比值为9∶1，发酵温度为 30℃ ，发酵时间为10d，发酵固液比为1∶2。

关键词： 鸢尾，生香菌，鸢尾酮，分离选育

香根鸢尾 (Iris pallida Lam.) 是鸢尾科 （ Iridales ） , 鸢尾属 （ Iris ） 多年生草本植物。其根茎可提取名贵香料 ： 鸢尾浸膏和凝脂 ， 其特征香味成分为鸢尾酮 ， 鸢尾酮 (Irone) 具有柔和的甜香 ， 香气清新纯正 ， 广泛用于食品、化妆品、香烟、香皂、衣物、纸张和书籍等产品。但 新鲜的鸢尾根茎并无特征香气，只有经过2～3年、甚至更长时间的陈化，待鸢尾酮前体物逐渐转化形成鸢尾酮后才具有香气，鸢尾根茎的贮藏陈化时间长，烦琐，占用大量的贮藏空间，部分异构体发

生不可逆的降解反应而损失。为了解决这些问题，人们通过 利用植物细胞培养、真菌或者过氧化物酶类可以实现鸢尾根状茎的亲脂提取物的生物转化,但是转化量较低 ^{[1、2、3、4、5]} 。

作者以新鲜香根鸢尾和陈化不同时间香根鸢尾根茎为实验材料，进行香根鸢尾内生真菌的分离，筛选出促使新鲜香根鸢尾根茎产生鸢尾酮的生香菌，并对所选菌株的产香条件进行研究，达到促使鸢尾酮转化量得到提高的目的，为利用微生物发酵方法促使鸢尾生香和制备特色鸢尾香料的工业化应用提供一定的依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1 分离生香菌材料及生香材料

生香材料是从云南寻甸县马街镇采集的新鲜香根鸢尾( Iris pallida Lam.)根茎。经去泥，清洗后，切片晒干，粉碎成粗粉备用。

选取新鲜香根鸢尾根茎和经陈化的香根鸢尾根茎为分离内生真菌的材料，其材料情况见表1。

1.1.2 培养基及试剂 [6]

马丁培养基；PDA培养基；液体发酵培养基(初筛、复筛)： 麦芽汁 15g ，葡萄糖 10g ，硫酸铜 2mg，氯化锌 2mg，柠檬酸三钠 2mg，硫酸铵 2mg，丙酮 1 d，新鲜鸢尾干粉 50g ，水 1000ml，pH 5.7； 固体发酵培养基(发酵)： 玉米粉 5g ，新鲜鸢尾根茎干粉 45g ，硫酸铜 2mg，氯化锌 2mg，柠檬酸三钠 2mg，硫酸铵2mg，丙酮 1.0ml，吐温80 1d；组织的表面消毒液(升汞溶液)。

1.2 方法^[6]

1.2.1 鸢尾生香菌的分离

将鸢尾根片用配制的消毒液进行表面消毒后，在无菌条件下将鸢尾片切成小块，点植于马丁氏平板培养基上，于 28℃ 恒温培养箱中培养3～7d，待样品边缘有菌落长出，将长出菌落的样品和相应菌落挑出，放入100mL无菌水中，在摇床上摇动2～5h，再利用平板稀释法挑单菌落，将单菌落转接于PDA培养基，即 得到分离菌株。

1.2.2 鸢尾生香菌的初筛

将所分离的菌株，经PDA活化后，接种到液体发酵培养基，在 30℃ 、170n/min的条件下摇床培养7d，进行产香培养观察实验，对发酵基质进行香气评定，检验是否出现具有鸢尾酮所特有的柔甜亲和的花香、紫罗兰香、鸢尾、桂花的甜香，筛选出具有使新鲜鸢尾生香的菌株，从而达到对鸢尾生香菌初筛的目的。

1.2.3 鸢尾生香菌的复筛

将经初筛后确定的具有生香能力的菌株，接种于液体发酵培养基，与此同时利用未接种的液体发酵培养基作相对应对照，在 30℃ 、170n/min的条件下摇床培养10d，培养结束后，将鸢尾根茎和相应的培养基利用同时蒸馏萃取方法进行萃取，这种萃取物内标物(茴香醚)存在下经GC/MS和GC分析得出每千克干重新鲜鸢尾根茎经生香菌发酵后所含的鸢尾酮重量，从而可以筛选出生香能力较好的菌株。

1.2.4 气相色谱-质谱联用分析条件

毛细管气相色谱柱HP-5MS( 0.25mm × 30m ×0.25 μ m),载气氦气，流速50ml/Min,分流比50：1，进样口温度 240℃ ，柱温：初温 130℃ 、保留1min，终温 250℃ 、保留5min，升温速率 5℃ ／min。电子轰击源EI，电离能量70EV，离子源温度 260℃ ，质量扫描范围为30-380 AMU，进样量1 μ L。

1.2.5 气相色谱标准曲线的制备

精密称取适量的鸢尾酮标准品，以二氯钾烷为溶剂，配制25 μ g/mL，40 μ g/mL,80 μ g/mL,120 μ g/mL,260 μ g/mL,600 μ g/mL浓度的鸢尾酮标准溶液，按前述气相色谱条件分析，以浓度为横坐标，鸢尾酮峰面积为纵坐标做线性回归，得回归方程。

1.2.6 新鲜鸢尾发酵条件研究 ^[7]

以鸢尾根茎∶玉米粉（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、酵固液比（D）进行四因素三水平的正交法研究，因素水平表见表2。以发酵新鲜香根鸢尾根茎中鸢尾酮含量为发酵条件优化的指标，从而选出最佳水平的组合。

2 结果与讨论

2 . 1鸢尾生香菌的分离

从香根鸢尾根茎共分离得到16株真菌，其中从新鲜鸢尾根茎分离得到6株，从陈化6个月的鸢尾根茎分离到3株，从陈化12个月的鸢尾根茎分离到3株，从陈化24个月的鸢尾根茎分离到2株，从陈化36个月以上的鸢尾根茎分离到2株。

2.2 鸢尾生香菌的初筛

将分离到16株真菌接种于 初筛培养基培养后，经专业人员进行嗅香评价，其结果见表3。 RS-016 、 RS-009 、 RS-007 、 RS-002 等 4 株真菌的初筛发酵培养液具有柔甜亲和的花香、紫罗兰香、鸢尾、桂花的甜香、奶甜香味、醇香等鸢尾特征性香味。

2.3 气相色谱标准曲线

利用鸢尾酮标准溶液进行气-质分析，以浓度为横坐标，鸢尾酮峰面积为纵坐标做线性回归，得回归方程Y＝2050.4400 X＋535.1348，r=0.9978。

2.4 鸢尾生香菌的复筛

将 RS-016 、 RS-009 、 RS-007 、 RS-002 等 4 株真菌 ， 接种于复筛培养基培养后 ， 其生长状况及嗅香评价见表 4 。经GC/MS和GC分析，并由标准曲线计算出每千克干重新鲜鸢尾根茎经生香菌发酵后所含的鸢尾酮量，见表5、图2：

图 2 鸢尾生香菌鸢尾酮含量比较
Fig2 The comparasion of the irone produced by different strains

从表4可以看出，对照的pH值变化，鸢尾仍呈粉粒状。处理样的pH值均呈现降低的趋势，说明经初筛后的4株菌具有产酸的能力。根据嗅香评价，都具有能促使新鲜鸢尾根茎生香的能力。

从表5和图2可以看出， 新鲜鸢尾根茎经Rs-007菌株生香发酵后鸢尾酮这一鸢尾特征香味物质含量较高，每千克新鲜鸢尾干粉经发酵后鸢尾酮含量的平均值达到720.19mg，经Rs－002、Rs-009、Rs-016菌株生香发酵后的平均含量分别为520.03mg、183.19mg、174.68mg。

2.5 新鲜鸢尾根茎生香发酵条件的正交法研究

利用 RS-007 菌株进行新鲜鸢尾生香发酵条件研究，其正交实验方案、结果和极差分析见表 6 ，其方差分析见表 7

从表 6 、表 7 可知， RS-007 菌株对新鲜鸢尾生香发酵条件的四个因素中，鸢尾根茎∶玉米粉的 R 值最大，可确定为主要因素，其次是发酵温度，再次是发酵时间，最后是发酵固液比，也就是，因素 A 是影响 Rs － 007 菌株进行新鲜鸢尾根茎生香和鸢尾酮转化的主要因素，因素 B 和 C 对其生香和鸢尾酮转化也有一定的影响，因素 D 对其生香和鸢尾酮转化的影响不明显。四因素的主次顺序为：鸢尾根茎∶玉米粉比值（ A ） > 发酵温度（ B ） > 发酵时间（ C ） > 发酵固液比（ D ）。从表中的 k 值可看出，鸢尾根茎∶玉米粉比值中以 A₂鸢尾酮含量最高，发酵温度中以 B₃ 最高，发酵时间因素中以C₃的最高，发酵固液比中以 D₁ 最高，将四个因素的最优水平结合在一起，得到鸢尾酮含量最高的处理组合 A₂B₃C₃D₁。最适新鲜鸢尾生香和鸢尾酮转化的发酵条件为：鸢尾根茎∶玉米粉比值（ 9 ∶ 1 ），发酵温度 30 ℃ ，发酵时间 10D ，发酵固液比 1 ∶ 2 。

2.6 新鲜鸢尾根茎生香正交发酵条件的回复实验

利用正交实验选出最佳水平的组合 A₂B₃C₃D₁进行回复实验，其结果见表 8 。

结果表明：RS-007菌株在所选最佳发酵水平的组合下进行回复实验，使新鲜鸢尾根茎能产生具有陈化鸢尾所特有的香味同时，还被赋有酿甜的发酵香味。经检测能使新鲜鸢尾根茎的鸢尾酮含量经发酵后其平均含量为1050mg/Kg。

3 结论

从新鲜的和经自然陈化的香根鸢尾根茎分离到16株内生真菌，通过初筛和复筛获得4株能促使新鲜根茎生香的内生真菌：RS-002、RS-007、RS-009和RS-016。并从中挑选出一株鸢尾酮高产菌株：Rs-007（720.19mg鸢尾酮/kg新鲜鸢尾干粉）。对 该菌株的产香条件进行正交法研究，正交实验的结果表明，影响发酵结果的四个因素的主次顺序为：鸢尾根茎∶玉米粉比值（A）>发酵温度（B）>发酵时间（C）>发酵固液比（D）。最适发酵条件：鸢尾根茎∶玉米粉比值为9∶1，发酵温度为 30℃ ，发酵时间为10d，发酵固液比为1∶2。RS-007菌株在所选最佳发酵水平的组合下进行回复实验，使新鲜鸢尾根茎能产生具有陈化鸢尾所特有的香味同时，还被赋有酿甜的发酵香味,使新鲜鸢尾根茎的鸢尾酮含量经发酵后其平均含量可达1050mg/Kg。

主要参考文献

[1]孙晓鹏,张玲琪.鸢尾微生物快速生香.中国食品添加剂, 1997,1:29-31.

[2]杨敏.从鸢尾鲜根茎中直接制取鸢尾酮的新工艺研究.精细化工.1999，16（增刊）：306-309.

[3]张玲琪,孙晓鹏,娄家凤.对鸢尾新鲜根状茎发酵生香的微生物研究.云南大学学报(自然科学版) 1997,19(4):362-365.

[4]张玲琪,谷甦,邵华,魏蓉城.发酵产鸢尾酮真菌的分离鉴定及生香特性的初步研究.菌物系统,1999,18(1):49-54.

[5]张玲琪,孙晓鹏.微生物发酵产生鸢尾酮的初步研究.云南大学学报(自科版),1996,18(2):176-179.

[6] 诸葛健，王正祥 . 工业微生物实验技术手册 [M] . 北京：中国工业出版社， 1994.

[7] 徐继初 . 生物统计及试验设计 . 农业出版社 .

Abstract 16 strains of funga were isolated from rhizome of Iris pallida . A strain No RS-007 was obtained by repeated screening. The aroma-producing conditions of it were studied through the method of experiments of orthogonal matrix. The experimental result showed that the influential extent of affecting factors to The aroma-producing conditions of No RS-007 were: A(the rate of rhizome to corn flour ) ＞ B(the temperature of fermentation) ＞ C(the time of fermentation) ＞ D(the rate of solid to liquid). The optimum medium of aroma-producing were as follows: the rate of rhizome to corn flour( 9 ∶ 1) ， the temperature of fermentation( 30 ℃ ) ， the time of fermentation(10d) ， the rate of solid to liquid( 1 ∶ 2).

Key Words: Iris pallida , Aroma-producing Fungus ， irone, Isolation and Selection